馮潔，柏熊，沈志敏，劉雄偉，謝建云，胡建華，高誠

(1.上海實驗動物研究中心，上海 201203;2.上海市實驗動物質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，上海 201203;3.上海西普爾－必凱實驗動物有限公司)

不同生存條件下東方田鼠肝臟基因表達(dá)譜分析

馮潔1，2，柏熊3，沈志敏1，劉雄偉1，謝建云1，胡建華1，高誠1

(1.上海實驗動物研究中心，上海 201203;2.上海市實驗動物質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，上海 201203;3.上海西普爾－必凱實驗動物有限公司)

目的 比較實驗室條件下飼養(yǎng)的東方田鼠和野外捕捉東方田鼠肝臟的基因表達(dá)差異，尋找可能參與肝臟病變的關(guān)鍵基因。方法 以實驗室條件飼養(yǎng)的東方田鼠和野外捕捉東方田鼠為研究對象，分別抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，體外轉(zhuǎn)錄為cRNA并進(jìn)行片段化;利用表達(dá)譜芯片分別進(jìn)行雜交，掃描后篩選差異基因，并應(yīng)用realtime PCR方法對部分基因的表達(dá)水平進(jìn)行進(jìn)一步測定，驗證芯片數(shù)據(jù)的結(jié)果。結(jié)果 實驗室飼養(yǎng)東方田鼠肝組織與野外捕捉東方田鼠相比，共有99個基因和41個EST差異表達(dá)。其中參與機(jī)體代謝的基因占主導(dǎo)，約占35.4%;其次為參與信號通路的基因，約占24.2%;參與細(xì)胞周期和免疫的基因分別占6.1%和3.0%。結(jié)論 利用基因表達(dá)譜芯片初步篩選了可能參與東方田鼠脂肪肝形成過程的基因，發(fā)現(xiàn)機(jī)體代謝通路的基因占主導(dǎo)，肝臟中細(xì)胞色素家族基因表達(dá)差異明顯。

東方田鼠;芯片;肝臟;細(xì)胞色素

東方田鼠(Microtus fortis)是一種常見的嚙齒類動物，主要分布在我國以及和我國接壤的俄羅斯、朝鮮、蒙古的部分地區(qū)，是一種重要的具有潛在應(yīng)用價值(作為實驗動物)的野生動物資源。目前東方田鼠較多地被用于抗血吸蟲病機(jī)制研究［1，2］，2003年有文獻(xiàn)報道了誘發(fā)性東方田鼠糖尿病動物模型的研究情況［3］。近年來我們對東方田鼠進(jìn)行實驗動物化研究過程中發(fā)現(xiàn)，實驗室飼養(yǎng)條件下的東方田鼠與野外捕捉東方田鼠相比有易發(fā)脂肪肝的傾向［4］。本文通過表達(dá)譜芯片對實驗室條件下飼養(yǎng)的東方田鼠和野外捕捉東方田鼠肝臟的基因表達(dá)差異進(jìn)行比較，旨在尋找可能參與肝臟病變的關(guān)鍵基因，為開拓東方田鼠作為人類疾病動物模型的應(yīng)用前景奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗室飼養(yǎng)洞庭湖種群東方田鼠由上海西普爾－必凱實驗動物有限公司提供［SYXK(滬)2008－0058］;野生洞庭湖種群東方田鼠捕自湖南洞庭湖湖區(qū)。

大鼠全基因組表達(dá)譜芯片 RatRef－12 BeadChip(產(chǎn)品目錄號A21005)，7300實時熒光定量 PCR儀購自Applied Biosystems公司，定量熒光染料 SYBR Green I購自上海開放科技公司。

1.2 組織樣品的收集

取實驗室飼養(yǎng)東方田鼠2只，雄性，體質(zhì)量80 g左右，經(jīng)乙醚麻醉后，打開腹腔剪取肝組織迅速于液氮中混合研磨，凍存，作為實驗組;按同樣的方法取野外捕捉東方田鼠2只，進(jìn)行樣品處理，作為對照組。

1.3 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

取大約100 mg肝臟粉末按Qiagen公司的QIA RNA Extraction Mini Kit步驟抽提 RNA。取抽提好的RNA 2 μg按Invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。剩余RNA樣品保存于－70℃。

1.4 芯片雜交

本實驗利用芯片分別與實驗室飼養(yǎng)東方田鼠和野外捕捉東方田鼠肝組織樣品進(jìn)行雜交。cRNA制備、芯片雜交、洗滌、掃描實驗以及數(shù)據(jù)收集工作由聯(lián)合基因科技集團(tuán)協(xié)助完成。

1.5 real-time PCR

為驗證基因芯片的結(jié)果，我們應(yīng)用 real－time PCR方法，對部分基因的表達(dá)水平進(jìn)行進(jìn)一步測定，驗證芯片數(shù)據(jù)的結(jié)果，更準(zhǔn)確地了解不同東方田鼠的基因表達(dá)差異。由于目前對東方田鼠的基因組信息研究的不夠深入，在美國國家生物信息中心(NCBI)中能搜索到與東方田鼠相關(guān)的序列信息量很少。因此，我們根據(jù)芯片上部分表達(dá)有差異的基因，選取 cyp2a3a、cyp2d5、decr1、arpp19 這四個基因，根據(jù)Genbank中大小鼠序列信息，通過同源比對找出同源性較高的區(qū)域，采用primer premier 5.0設(shè)計特異性的跨內(nèi)含子real－time PCR引物，對東方田鼠肝臟中的表達(dá)水平作進(jìn)一步測定，引物序列見表1。本實驗所用內(nèi)參基因為gapdh。

PCR反應(yīng)循環(huán)過程中設(shè)置合適的讀板溫度，讀板時間為每次1 s，以收集熒光信號。在65～95℃之間進(jìn)行熔解曲線的繪制。

2 結(jié)果

2.1 總mRNA提取結(jié)果

總RNA樣品的 D260/D280＞1.9，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，28 s、18s條帶比較清晰、銳利，無DNA雜帶(圖1)，說明RNA樣品的質(zhì)量合格，可用于進(jìn)一步實驗。

1.實驗室飼養(yǎng)東方田鼠肝RNA;2.野外捕捉東方田鼠肝RNA圖1 東方田鼠肝臟總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖1.Total liver RNA from Microtus fortis raised in lab;2.Total liver RNA from Microtus fortis captured in wildFig.1 Agarose gel electrophoresis pattern of hepatic total RNA from the liver of Microtus fortis

2.2 表達(dá)譜芯片篩選結(jié)果

圖2為基因芯片雜交信號強(qiáng)度的散點圖。X軸、Y軸分別以 Cy3和 Cy5熒光強(qiáng)度值為坐標(biāo)，每一個數(shù)據(jù)點代表芯片上一個基因點的雜交信號。如圖所示，數(shù)據(jù)點集中在三條直線之間，則代表Y值與X值的比值在0.5至2.0之間，基本屬非差異表達(dá)基因;數(shù)據(jù)點在直線之外，則代表Y值與 X值的比值在0.5到2.0范圍之外，表明該點很可能屬于差異表達(dá)基因。

圖2 基因芯片雜交信號強(qiáng)度的散點圖Fig.2 Scatter diagram of hybridization signal intensity on the gene chip

表 1 real－time PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences determined by real－time PCR

實驗室飼養(yǎng)東方田鼠肝組織與野外捕捉東方田鼠相比，共有99個基因和41個EST差異表達(dá)。從差異基因功能上來看，參與機(jī)體代謝途徑的基因表達(dá)活躍，約占35.4%;其次為參與信號通路的基因，約占24.2%;參與細(xì)胞周期和免疫的基因分別占6.1%和3.0%;參與細(xì)胞骨架和其他的基因約占31.3%。部分差異基因的情況見表2。

2.3 Real-time PCR

確定每組樣品的Ct值，即目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。再根據(jù)2－ΔΔCt公式計算表達(dá)差異。其中 ΔCt=目的基因的 Ct－內(nèi)參基因的Ct，ΔΔCt= 實驗組的 ΔCt－ 對照組的 Ct。

我們對不同基因在芯片和 real－time PCR中所呈現(xiàn)的表達(dá)變化結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果表明芯片和real－time PCR中基因表達(dá)的變化差異趨勢基本上一致，見圖3。

圖3 基因芯片和real－time PCR中基因表達(dá)差異比較圖Fig.3 Comparison ofgene expressions revealed by microarray and real－time PCR

3 討論

非酒精性脂肪肝病(non－alcoholic fatty liver diseases，NAFLD)是一種無過量飲酒史、以肝實質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征，NALFD病理機(jī)制并未完全明了，目前認(rèn)為是一種多基因共同參與的結(jié)果，其發(fā)病機(jī)制與胰島素抵抗和代謝綜合征有關(guān)，其中占主導(dǎo)地位的觀點是Day提出的“二次打擊假說”［5，6］。如今人們已在大鼠、沙鼠、小鼠、兔、豬等動物上成功建立了脂肪肝動物模型，為發(fā)病機(jī)理和診斷治療提供了機(jī)會［7－10］。近年來我們對東方田鼠進(jìn)行一系列實驗動物化研究中發(fā)現(xiàn)，實驗室飼養(yǎng)條件下的東方田鼠肝組織經(jīng)病理切片分析，均可見大量大小不一的脂滴空泡和不同程度的病理異常現(xiàn)象，而野外捕捉東方田鼠未見脂肪肝的發(fā)生，說明東方田鼠有易發(fā)脂肪肝的傾向［4］。

本文利用全基因組表達(dá)譜芯片，對不同生存條件下東方田鼠肝臟的基因表達(dá)譜差異進(jìn)行了篩查。由于當(dāng)前東方田鼠基因組信息知之甚少，更沒有相關(guān)的芯片產(chǎn)品。因此，我們采用大鼠全基因組表達(dá)譜芯片進(jìn)行實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗室飼養(yǎng)的動物與野外捕捉東方田鼠相比，不同功能的基因表達(dá)均顯示有差異，但參與機(jī)體代謝的基因占主導(dǎo)。肝臟中細(xì)胞色素家族基因表達(dá)差異明顯，如 cyp2c55，cyp2d5，cyp2d26等。醛－酮還原酶(akria1)、胍基乙酸 N－甲基轉(zhuǎn)移酶(gamt)、蛋白磷脂酶3(ppp3r1)、雙烯酰輔酶A還原酶1(decr1)等一系列參與機(jī)體代謝的酶均有不同程度的表達(dá)變化。我們推測可能是由于飼料、生存環(huán)境等不同因素的綜合影響，使實驗室條件下東方田鼠機(jī)體代謝系統(tǒng)發(fā)生自身調(diào)節(jié)。上述結(jié)果提示我們，東方田鼠有可能作為脂肪肝的研究模型，具有潛在的應(yīng)用價值。

目前關(guān)于NAFLD的致病機(jī)理研究較為熱門的基因之一為細(xì)胞色素P450(CYP2E1)。CYP2E1是細(xì)胞色素P450家族的成員，屬于血紅素蛋白超家族，參與許多內(nèi)源性化合物和外源性人造化學(xué)物質(zhì)的氧化代謝反應(yīng)，包括類固醇、脂肪酸、類視黃醇、膽汁酸、生物胺等，CYP2E1與脂肪肝的脂質(zhì)過氧化損傷程度也密切相關(guān)，當(dāng)基因表達(dá)發(fā)生變化，內(nèi)外源物質(zhì)經(jīng)其代謝活化后形成細(xì)胞毒性更大的物質(zhì)，會引起肝細(xì)胞損傷［11，12］。雙烯酰輔酶 A還原酶 1(Decr1)是一種過氧化物酶體，近年來發(fā)現(xiàn)是不飽和脂肪酸D氧化的關(guān)鍵酶，對脂肪沉積具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［13，14］。

表2 基因芯片中部分表達(dá)差異顯著基因簡略表Tab.2 Part of differentially expressed genes in the liver of Microtus fortis raised in lab

我們采用 real－time PCR方法對部分芯片結(jié)果進(jìn)行驗證。結(jié)果表明芯片和 real－time PCR中基因表達(dá)的變化差異趨勢一致，進(jìn)一步提示我們這些基因可能對東方田鼠機(jī)體脂肪代謝過程起重要調(diào)節(jié)作用，從而推進(jìn)了肝臟病變的進(jìn)程。具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

隨著人類基因組計劃的完成以及蛋白質(zhì)組研究的開始，基因功能的研究已顯得十分必要?；蛐酒?gene chip)也叫 DNA芯片、DNA微陣列(DNA microarray)、寡核苷酸陣列(oligonucleotide array)，是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一項尖端技術(shù)，是后基因組時代基因功能分析的最重要技術(shù)之一，具有高通量、快速、準(zhǔn)確分析基因的優(yōu)點，在基因功能研究、疾病診斷以及新藥的開發(fā)等方面顯示了巨大的潛力［15］。本文對東方田鼠肝臟的基因表達(dá)譜進(jìn)行檢測，目的在于初步篩選可能參與脂肪肝形成過程的基因，為東方田鼠作為實驗動物模型的開發(fā)利用提供新的信息，同時也為脂肪肝的發(fā)病機(jī)制和診斷治療提供新的實驗動物模型和思路。

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Gene Expression Analysis in the Liver of Microtus fortis Living under Different Conditions

FENG Jie1，2，BO Xiong3，SHEN Zhi－min1，LIU Xiong－wei1，XIE Jian－yun1，HU Jian－h(huán)ua1，GAO Cheng1
(1.Shanghai Laboratory Animal Research Center，Shanghai 201203，China;2.Shanghai Quality Monitoring Centre for Laboratory Animals，Shanghai 201203，China 3.Shanghai Xipu＇er－Bikai Laboratory Animal Limited Company，Shanghai 200237，China)

ObjectiveTo investigate the changes of gene expression in the liver of Microtus fortis raised in lab and captured in wild，and to find the genes involved in liver pathology.MethodsThe cDNA of liver were reverse transcripted from RNA extracted from Microtus fortis raised in lab and captured in wild.The cRNA derived from the transcription of cDNA were fragmented as probes.The probes were hybridized with microarray.The hybridization signals were screened by gene array scanner.Real－time PCR was performed to further confirm the gene expression profiling data from the gene chip.ResultsThere were 99 genes and 41 EST differentially expressed between raised and wild Microtus fortis.Genes participating in the body metabolism predominantly accounted for 35.4%，next were genes participating in signal pathway，24.2%.Genes participating in cell cycle and immune were 6.1%and 3.0%，respectively.Conclusions Genes participating in organism metabolism are predominantly differently expressed in Microtus fortis raised in lab and captured in wild.Expression of cytochrome family in the liver is significantly different.

Microtus fortis;Microarray;Liver;Cytochrome

R349.31

A

1005－4847(2010)06－0498－05

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.06.011

2010－08－02

上海市科學(xué)基金資助項目(No.071409001)。

馮潔(1981－)，助理研究員，碩士，研究方向為實驗動物質(zhì)量控制與模型研究。

謝建云(1968－)，研究員，E－mail:xiejianyun@hotmail.com