王青竹，高學(xué)軍，盧志勇，駱超超，劉曉飛，于 微，李學(xué)琳

（乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

隨著我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的增長(zhǎng)，人民生活水平的提高，廣大消費(fèi)者對(duì)飲食結(jié)構(gòu)也有了新的更高的要求[1-2]。人們選擇飲食時(shí)不僅考慮能滿(mǎn)足營(yíng)養(yǎng)的需求，同時(shí)也越來(lái)越考慮其風(fēng)味、保健、治療效果[3]。在生產(chǎn)面包、糧食飲料及米酒等谷物發(fā)酵食品時(shí)，將有某些特性的益生菌加入其中，或是提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，或是改良其風(fēng)味，則將會(huì)生產(chǎn)出適合人們對(duì)其要求越來(lái)越高的飲食物品。近年來(lái)微生物產(chǎn)香由于更天然健康所以倍受關(guān)注[4]，Jean等研究發(fā)現(xiàn)微生物通過(guò)酶水解機(jī)制影響釀酒的芳香物質(zhì)釋放[5]，許多學(xué)者對(duì)谷物發(fā)酵食品的產(chǎn)香進(jìn)行了相關(guān)研究，劉信中等人通過(guò)對(duì)啤酒芳香性物質(zhì)的氣相色譜質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)了其中包含乙醇、2-苯乙醇和乙酸異戊酯[6-7]，陳妙蘭等通過(guò)對(duì)白酒的芳香性物質(zhì)的氣相色譜質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)了其中包含乙醇、2-苯乙醇、3-羥基2-丁酮、冰乙酸、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯和壬酸乙酯[8-10]，楊秀琴等通過(guò)對(duì)酸面團(tuán)的芳香性物質(zhì)進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)了其中包含乙醇、2-苯乙醇、3-羥基2-丁酮、甲酸丙酯和壬酸乙酯[11]。通過(guò)上述學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)醇類(lèi)和酯類(lèi)對(duì)谷物發(fā)酵產(chǎn)品的芳香性有很大影響。

本試驗(yàn)從谷物食品中篩選出66種菌種及實(shí)驗(yàn)室保存的12種菌種，通過(guò)氣相色譜分析、PCR鑒定及Blast分析，最后選擇其中3種分別產(chǎn)芳香性物質(zhì)乙醇、2-苯乙醇、甲酸丙酯最多的益生菌種，分別加到用面粉發(fā)酵饅頭、用玉米粉發(fā)酵發(fā)糕及制造飲料、用糯米粉發(fā)酵粘豆包及發(fā)酵飲料的過(guò)程中，以期在增加它們的風(fēng)味方面有所改進(jìn)，從而生產(chǎn)出更適應(yīng)人們需求的具有良好風(fēng)味性的新型饅頭、發(fā)糕、粘豆包、玉米飲料及大米乳酸飲料等食品。

1 材料與方法

1.1 材料

大列巴、饅頭、發(fā)面餅、麻花、白酒酒曲、米酒、玉米面、面粉、糯米（以上均為哈爾濱市食品市場(chǎng)地產(chǎn)產(chǎn)品）和本實(shí)驗(yàn)室已有的12種菌株1.1625、1.0625、1.1086、1.9201、200402、200204、10.0353、10.0357、1.2471、1.2467、1.1482、1.29。

1.2 儀器與試劑

儀器：島津公司GC-14C氣相色譜儀、DM-inertwax 30 m×0.25 mm，ID 0.25 μm 氣相色譜柱、SHG-300高純氫發(fā)生器、SGK-2LB低噪音空氣泵、DH6000A型電熱恒溫培養(yǎng)箱、SPX-250C型恒溫恒濕箱、TDL-5000B冷凍離心機(jī)。

試劑：乙醇（Ethanol）、3-羥基2-丁酮（3-Hydroxy-2-Butanone）、甲酸丙酯（Propyl Formate）、乙酸苯乙酯（Phenylethyl Acetate）、乙酸甲酯（以上均為色譜純）、乙酸乙酯（Ethyl Acetate）、壬酸乙酯（Ethyl Nonanoate）、冰乙酸（Acetic Acid）（以上均為分析純）、糖化酶、淀粉酶。

1.3 菌種篩選

1.3.1 試驗(yàn)方法

將面包、麻花、饅頭、發(fā)面餅、大列巴、粘豆包等發(fā)酵谷物的生面團(tuán)、白酒曲和米酒通過(guò)微生物培養(yǎng)分離，獲取單一菌種保存，將分離出的66種菌株和實(shí)驗(yàn)室保存的12種菌株接入液態(tài)培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h，離心取上清，上清液濾膜過(guò)濾后取2 μL樣品直接用氣相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 色譜檢測(cè)結(jié)果

氣相色譜選用M-inertwax 30 m×0.25 mm，ID 0.25 μm氣相色譜柱，在摸索好的條件下確定芳香物質(zhì)的保留時(shí)間，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，然后對(duì)每個(gè)菌種進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，最終測(cè)定含量。

1.3.3 菌種的鑒定

通過(guò)氣相色譜的檢測(cè)篩選出了1.0625、1.1086、1.2467、B3、B7、B9等6株菌種，然后通過(guò)初步鏡檢、糖發(fā)酵試驗(yàn)確定菌種類(lèi)型，然后利用16rDNA、18SrDNA鑒定及blast分析、特異性引物PCR等技術(shù)鑒定，鑒定結(jié)果為：AS 1.2467（嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidophilus，GenBank：EU483 105.1）、AS1.0625（保加利亞乳桿菌 Lacbobacillus bulgaricus， GenBank:AB494733.1）、 AS1.1086（納豆芽孢桿菌Bacillus natto，GenBank:GU826165.1）、B7（釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae，GenBank：AY251636.1）、B3（克魯斯假絲酵母 Candida krusei，GenBank：M55528.1）、B9（東方伊薩酵母 Issatchenkia orientalis，GenBank：DQ438180.1）。

最后通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)的查閱，得出結(jié)論有三株菌株適合應(yīng)用到食品當(dāng)中，即為1.2467號(hào)菌嗜酸乳桿菌、1.0625號(hào)菌保加利亞乳桿菌、B7號(hào)菌釀酒酵母。

1.4 發(fā)酵試驗(yàn)

1.4.1 發(fā)酵饅頭、發(fā)糕和粘豆包

材料：面粉600 g、水300 mL。

做法：將所有面粉加入水300 mL混合成團(tuán)，將面團(tuán)均分為4組小面團(tuán)，每個(gè)小面團(tuán)再分為3個(gè)平行。第一組小面團(tuán)為對(duì)照面團(tuán)，第二組小面團(tuán)接入嗜酸乳桿菌1 mL，第三組小面團(tuán)接入保加利亞乳桿菌1 mL，第四組小面團(tuán)接入釀酒酵母1 mL，將面團(tuán)分別揉至有筋度，面團(tuán)表皮光滑為止（約揉5～10 min）。將面團(tuán)分別放在大碗中，覆蓋保鮮膜等它發(fā)酵至兩倍大，約45～50 min（天氣冷時(shí)發(fā)酵時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)）。發(fā)糕和粘豆包的制作方式如上，分別得到發(fā)糕面團(tuán)1～4組和粘豆包面團(tuán)1～4組，每組均有3個(gè)平行。等發(fā)糕和粘豆包面團(tuán)發(fā)好后，每個(gè)面團(tuán)做成大小均勻的饅頭上屜蒸，大約15 min。所得四組發(fā)酵產(chǎn)品從視覺(jué)、嗅覺(jué)、味覺(jué)三個(gè)感官角度進(jìn)行評(píng)定，最后得出結(jié)論。

1.4.2 玉米面制作玉米飲料[12]

稱(chēng)取等量的適量玉米面4份，編為四組，每組分3個(gè)平行，每個(gè)平行80 g玉米面，按1：2比例加水，200 U·g-1單位加入糖化酶，在121℃條件下滅菌20 min，即為玉米發(fā)酵料。第一組接種為空白組，第二組接種嗜酸乳桿菌，第三組接種保加利亞乳桿菌，第四組接種釀酒酵母，接種量均為0.3%～0.5%。發(fā)酵溫度43℃、發(fā)酵時(shí)間20 h。發(fā)酵完后就四組產(chǎn)品的特征香氣、口感、酒香、甜酸比、綜合風(fēng)味打分比較[13]。

1.4.3 糯米制作糯米飲料[14]

糯米飲料制作方法如下：將大米分成4份120℃蒸汽殺菌10 min，編為4組，每組分為3個(gè)平行，每個(gè)平行大米30 g，水200 mL。第一組空白對(duì)照組接入淀粉酶，第二組接入嗜酸乳桿菌和淀粉酶，第三組接入保加利亞乳桿菌和淀粉酶，第四組接入釀酒酵母和淀粉酶，菌種接入量均為0.3%～0.5%、淀粉酶0.05%～0.2%，在30℃培養(yǎng)15 h。發(fā)酵完后就四組產(chǎn)品的特征香氣、口感、酒香、甜酸比、綜合風(fēng)味打分比較。以上試驗(yàn)經(jīng)由50人品嘗，從視覺(jué)、嗅覺(jué)、味覺(jué)等多個(gè)角度進(jìn)行感官評(píng)定，以問(wèn)卷調(diào)查的形式得出最終結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)芳香復(fù)制益生菌的篩選

結(jié)果見(jiàn)表1。

篩選出了 1.0625、1.1086、1.2467、B3、B7、B9等6株菌種，然后通過(guò)通用引物PCR、Blast分析及特異性引物PCR的鑒定，通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)的查閱，得出結(jié)論有3株菌株適合應(yīng)用到食品當(dāng)中，即為1.2467號(hào)菌嗜酸乳桿菌（1.2467）、1.0625號(hào)菌保加利亞乳桿菌（1.0625）、B7號(hào)菌釀酒酵母（2.1427）。其中1.2467號(hào)菌種產(chǎn)2-苯乙醇量最高，1.0625菌種產(chǎn)甲酸丙酯量最高，B7菌種產(chǎn)乙醇量最高。

表1 篩選出的菌株通過(guò)氣相色譜檢測(cè)所得芳香物質(zhì)的含量Table1 Content of aromatic substances of selected strains by gas chromatography （mg·L-1）n=3

2.2 發(fā)酵結(jié)果

2.2.1 面粉發(fā)酵饅頭、玉米粉發(fā)酵發(fā)糕、糯米粉發(fā)酵粘豆包的感官評(píng)定

釀酒酵母產(chǎn)品口感稍甜、氣味醇香更適合發(fā)酵饅頭、發(fā)糕。在發(fā)酵饅頭、發(fā)糕、粘豆包時(shí)產(chǎn)品味覺(jué)偏酸，但產(chǎn)香效果良好適合與其他菌種混合發(fā)酵，以提高產(chǎn)香效果。嗜酸乳桿菌發(fā)酵饅頭、發(fā)糕、粘豆包等產(chǎn)品口味偏酸，香味不是十分明顯，故不適合發(fā)酵以上產(chǎn)品。結(jié)果見(jiàn)表2～4。

表2 不同菌種發(fā)酵饅頭的感官評(píng)定Table2 Sensory evaluation of bread fermented by different bacterium

表3 不同菌種發(fā)酵發(fā)糕的感官評(píng)定Table3 Sensory evaluation of steamed sponge cake fermented by different bacterium

表4 不同菌種發(fā)酵粘豆包的感官評(píng)定Table4 Sensory evaluation of rice cake fermented by different bacterium

2.2.2 玉米面制作玉米飲料、糯米制作糯米飲料的感官評(píng)定

由表5、6可知，嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)品口感微酸、氣味具有獨(dú)特米香，故發(fā)酵糯米和玉米酸性飲料比較適合，釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)品酒香味較濃郁，故發(fā)酵糯米和玉米酒精飲料比較適合。

表5 不同菌種發(fā)酵玉米飲料的感官評(píng)定Table5 Sensory evaluation of corn drink fermented by different bacterium

表6 不同菌種發(fā)酵糯米飲料的感官評(píng)定Table6 Sensory evaluation of sticky rice drink fermented by different bacterium

3 討論與結(jié)論

人類(lèi)對(duì)食品的獲取，不僅是身體上的一種需求，也是心理上的一種享受。具有良好或獨(dú)特風(fēng)味的食品，會(huì)使人們?cè)谛睦锷稀⒏泄偕系玫秸嬲臐M(mǎn)足，并直接影響其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的消化和吸收。在對(duì)發(fā)酵谷物中的菌種研究發(fā)現(xiàn)酸面團(tuán)面包的產(chǎn)香與酵母和乳酸菌有很大關(guān)系，通過(guò)乳酸菌發(fā)酵可提高糯米飲料[15]和玉米飲料的品質(zhì)和香味[16]，Dung等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)用多種酵母菌和霉菌發(fā)酵紫色糯米釀制的米酒具有獨(dú)特的芳香性[17]，酵母在發(fā)酵波爾多葡萄酒過(guò)程中對(duì)它的香氣也有很大影響[18]，乳酸菌對(duì)保加利亞當(dāng)?shù)氐木凭燥嬃蟗oza風(fēng)味也有調(diào)節(jié)作用[19]，作為北方特色傳統(tǒng)食品的粘豆包也可以通過(guò)對(duì)其中益生菌的調(diào)控達(dá)到改善其感官品質(zhì)的目的[20]。

本試驗(yàn)從谷物食品中篩選出66種菌種及實(shí)驗(yàn)室保存的12種菌種，通過(guò)氣相色譜分析、PCR鑒定及Blast分析，最后選其中3種分別產(chǎn)芳香性物質(zhì)乙醇、2-苯乙醇、甲酸丙酯最多的益生菌種分別為釀酒酵母、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌，我們用這三種菌種分別發(fā)酵饅頭、發(fā)糕、粘豆包和谷物乳酸飲料，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母適合發(fā)酵面食和發(fā)酵酒精性飲料，保加利亞乳桿菌適合面食增香和發(fā)酵谷物酸性飲料，嗜酸乳桿菌適合發(fā)酵谷物酸性飲料。

現(xiàn)在大部分的研究集中在對(duì)發(fā)酵食品產(chǎn)芳香物質(zhì)的氣相色譜質(zhì)譜分析和從感官判定益生菌對(duì)發(fā)酵食品產(chǎn)香的影響，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)氣相色譜對(duì)芳香性物質(zhì)的檢測(cè)，從菌種產(chǎn)芳香性物質(zhì)多少的角度入手，選擇了產(chǎn)芳香性物質(zhì)較多的釀酒酵母、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌3種菌，再用這3種菌分別發(fā)酵不同種的發(fā)酵食品，從中選擇出最適合不同種發(fā)酵食品發(fā)酵的對(duì)應(yīng)菌種，從而達(dá)到使發(fā)酵食品增香的目的，最終得到產(chǎn)香性能優(yōu)良的產(chǎn)品。在用釀酒酵母發(fā)酵饅頭、發(fā)糕和粘豆包的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)品口感微甜，氣味醇香較適合發(fā)酵面食，保加利亞乳桿菌在發(fā)酵過(guò)程中氣味醇香，但發(fā)酵產(chǎn)品微酸，如果發(fā)酵面食需要在配方做出調(diào)整，嗜酸乳桿菌在發(fā)酵過(guò)程中口味偏酸，氣味也無(wú)突出效果，故不太適合發(fā)酵面食。嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵谷物飲料所得產(chǎn)品口感微酸、有米香味，適合發(fā)酵谷物酸性飲料。如果添加適量的糖進(jìn)行調(diào)節(jié)，效果會(huì)更好。釀酒酵母發(fā)酵谷物飲料所得產(chǎn)品有酒香味，適合發(fā)酵酒精性飲料。

有報(bào)道單一的菌種發(fā)酵不能使發(fā)酵食品達(dá)到最佳效果，將乳酸菌和酵母按比例混合對(duì)發(fā)酵面食增香會(huì)有更好的效果[21]，保加利亞乳桿菌與嗜酸乳桿菌按比例混合對(duì)谷物發(fā)酵飲料也有更好的增香效果[22]，保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和釀酒酵母按比例組合添加到玉米發(fā)酵飲料中能產(chǎn)生獨(dú)特的味[23]。通過(guò)菌種的特性按照不同比例組合會(huì)產(chǎn)生不同的效果，也更能適應(yīng)不同種的谷物發(fā)酵食品的需求，今后我們應(yīng)再開(kāi)展復(fù)合菌種發(fā)酵的相關(guān)研究。

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