王繼佳，李鳳蘭，韓 峰，孫麗麗，金 峰

（東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

仙客來（Cyclamen premium Mill.）屬報春花科仙客來屬的多年生球根草本植物，是世界著名的節(jié)日小盆花之一。仙客來灰霉病是溫室中常見的真菌病害[1]，其病原為富克爾核盤菌，屬子囊菌門真菌，由氣流傳播，主要通過傷口侵入植物體。該病主要發(fā)生在葉片、葉柄、花梗和花瓣上[2]。據(jù)2005年調(diào)查，仙客來灰霉病在1～3月低溫時發(fā)病率高達90%，對花卉種子的產(chǎn)量和品質(zhì)均有很大影響[3]。近幾年來，由于連年栽培、菌源積累等原因，仙客來的灰霉病病害越來越重，已成為影響仙客來欣賞價值和商品價值的關(guān)鍵因素。有關(guān)仙客來灰霉病的研究主要集中在病原鑒定及診斷和防治等方面[3-5]，而對患病植株營養(yǎng)器官內(nèi)部變化的研究則少有報道。

本文運用石蠟切片技術(shù)對患灰霉病仙客來植株的葉片、葉柄、花、花梗進行了解剖學觀察，為進一步研究仙客來灰霉病的起源、發(fā)生、傳播及其防治提供解剖學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

仙客來的正常植株和染灰霉病的典型病株為同一品種，其來源于東北農(nóng)業(yè)大學植物學實驗室。

1.2 方法

選取仙客來染病植株具有代表性的葉片（長0.5 cm，寬0.3 cm）、葉柄（0.5 cm）、花（長0.5 cm，寬0.3 cm）、花梗（0.5 cm），用FAA固定24 h以上，常規(guī)石蠟切片法制片，切片厚度為l0 μm，番紅-固綠雙重染色，封片后，于OLYMPUS光學顯微鏡下觀察并拍照。

本研究選擇6種組織內(nèi)的細胞,在顯微鏡下每種組織隨機選取5個視野，觀察每個視野中含有菌絲或孢子的細胞比例，并計算出在此組織中的平均數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病植株的外部形態(tài)特征

對正常仙客來植株和患灰霉病植株外觀形態(tài)的對比觀察，發(fā)現(xiàn)灰霉病主要危害葉片、葉柄及花冠（見圖1、2）。由觀察結(jié)果可以看出，灰霉病主要危害葉片、葉柄及花冠。染病葉片表面有暗綠色水漬狀病斑，干燥條件下葉斑呈“V”字形褐斑，看不見灰霉；葉柄和花梗呈水漬狀腐爛；花瓣發(fā)病時變色，白色品種花瓣變成淡褐色，紅色品種的花瓣退色，并出現(xiàn)水漬狀圓斑，病重時花瓣腐爛，密生灰色霉層，即病原菌分生孢子?；蚍稚咦樱绊懹^賞性，這些特點與已報道結(jié)果一致[4]。

圖1 正常仙客來植株的葉片和花瓣Fig.1 Leaves and flowers of normal cyclamen plant

圖2 感病仙客來植株的葉片和花瓣Fig.2 Leaves and flowers of cyclamen plant with Botrytis cinerea infection

2.2 灰霉病病原菌對仙客來器官的侵染方式

在番紅-固綠的染色條件下，灰霉病病原菌的菌絲被染成綠色，分生孢子被染成紅色[6]。對患病的不同器官進行解剖學觀察發(fā)現(xiàn)，病原菌主要通過器官的表皮進行侵染，但不同器官的侵染過程有所差別。從患病葉片來看，病原菌大部分是以菌絲直接通過葉片下表皮細胞進入葉片組織，并在表皮細胞中產(chǎn)生大量分生孢子，從而破壞表皮細胞（見圖3）。

圖3 感病仙客來葉片橫切面（×100）Fig.3 Transverse section of cyclamen leaves with Botrytis cinerea infection（×100）

病原菌對花瓣的侵染過程與之相似，也是首先在表皮細胞中產(chǎn)生了大量菌絲，繼而侵染內(nèi)部組織細胞（見圖4）。病原菌對仙客來葉柄和花梗的侵染，都是通過表皮進行的，其破壞表皮細胞的方式同葉片相似，即在表皮細胞中產(chǎn)生大量分生孢子（見圖5）。

圖4 感病仙客來花瓣橫切面（×400）Fig.4 Transverse section of cyclamen flowers with Botrytis cinerea infection（×400）

2.3 患灰霉病仙客來植株中的病原菌分布及其存在狀態(tài)

2.3.1 灰霉病病原菌在葉片中的分布及其存在狀態(tài)

圖5 感病仙客來花梗縱切面（×100）Fig.5 Vertical section of cyclamen pedicels with Botrytis cinerea infection（×100）

由表1可知，灰霉病病原菌的菌絲及分生孢子在葉片不同組織中的分布有很大差異。上下表皮中菌絲分布量較多，而其他組織中菌絲分布較少，尤其在韌皮部中，幾乎沒有菌絲存在；分生孢子在葉片的下表皮中分布量較大，并且密集度達到最高，為44.0%，而上表皮中的分生孢子量卻很少，只有6.0%，這與解剖結(jié)構(gòu)觀察到病原菌通過葉片下表皮進行侵染的結(jié)論相一致。在葉脈的木質(zhì)部和韌皮部中也有較多的分生孢子存在（見圖3）。

表1 灰霉病病原菌在葉片中的分布及其存在狀態(tài)Table1 Distribution and state of pathogens in cyclamen leaves (%)

2.3.2 灰霉病病原菌在葉柄中的分布及其存在狀態(tài)

由表2可知，菌絲在葉柄中主要分布于表皮、皮層和韌皮部，其中在韌皮部中的含量最多，達到了極顯著的水平，而木質(zhì)部和髓中幾乎沒有菌絲的存在。在葉柄的不同組織細胞中都有病原菌的分生孢子，分生孢子呈圓形。葉柄表皮細胞中的分生孢子數(shù)量最多，達到40.6%，明顯高于其他組織，其中木質(zhì)部中的含量最少。葉柄髓部受病原菌感染的程度最低（見圖6）。

表2 灰霉病病原菌在葉柄中的分布及其存在狀態(tài)Table2 Distribution and state of pathogens in the cyclamen petioles (%)

圖6 感病仙客來葉柄橫切面（×40）Fig.6 Transverse section of cyclamen petioles with Botrytis cinerea infection（×40）

2.3.3 灰霉病病原菌在花瓣中的分布及其存在狀態(tài)

由表3可知，花瓣表皮細胞中存在著較多的絲狀菌絲和分生孢子，而薄壁細胞中分生孢子和菌絲的含量都較少。在花瓣維管束中分生孢子最多，為41.3%，但菌絲的含量最少，只有11.0%（見圖7）。這同灰霉病病原菌在葉片和葉柄各組織中的分布趨勢相一致。

表3 灰霉病病原菌在花瓣中的分布及其存在狀態(tài)Table3 Distribution and state of pathogens in cyclamen flowers (%)

圖7 感病仙客來花瓣橫切面（×400）Fig.7 Transverse section of cyclamen flowers with Botrytis cinerea infection（×400）

2.3.4 灰霉病病原菌在花梗中的分布及其存在狀態(tài)

由表4可知，在花梗中，幾乎沒有菌絲，病原菌主要以分生孢子的形式存在，其中表皮細胞中的分生孢子數(shù)量最多，達49.8%，而韌皮部中的量最低，僅為2.0%（見圖8）。

表4 灰霉病病原菌在花梗中的分布及其存在狀態(tài)Table4 Distribution and state of pathogens in cyclamen pedicels (%)

圖8 感病仙客來花梗縱切面（×400）Fig.8 Vertical section of cyclamen pedicels with Botrytis cinerea infection（×400）

3 討論與結(jié)論

3.1 石蠟切片技術(shù)在患灰霉病仙客來器官觀察中的應用

對受到真菌病害侵染的植株內(nèi)部變化的觀察方法主要有細胞、亞細胞水平、生理生化以及基因分子水平的方法[7]。本試驗采用石蠟切片技術(shù)結(jié)合番紅-固綠染色方法對仙客來患病植株的器官進行解剖學觀察，主要是從細胞水平上揭示仙客來感染灰霉病后其感病器官的解剖結(jié)構(gòu)特征。由于被真菌感染的細胞壁角質(zhì)化加厚[8]，經(jīng)番紅-固綠染色后呈紅色，因此有利于對感病細胞的確定和觀察；此外，細胞中的分生孢子和菌絲在染色中呈現(xiàn)出不同的顏色反應，其中分生孢子易被番紅染成紅色，而菌絲則被固綠染成綠色，也便于試驗結(jié)果的觀察，因此，石蠟切片方法可以用于受真菌侵染植株的內(nèi)部變化的觀察。

3.2 仙客來植株被灰霉病病原菌侵染方式和位置

植物病原真菌侵入寄主并在寄主組織中生長是其致病的先決條件[8]。病原菌在入侵寄主時，通常會產(chǎn)生一些由特化的菌絲形成的侵染結(jié)構(gòu)，如：侵染墊[9-10]、附著胞[11]、侵染釘和吸器[12-13]等來幫助入侵并與寄主建立寄生關(guān)系。但是，侵染墊和附著胞并不是侵入所必需的[14]。所以病原菌的侵染可歸納為以侵染墊或裂片狀附著胞侵染、不產(chǎn)生專門侵染結(jié)構(gòu)由菌絲頂端直接穿透植物表面或從自然孔口（主要是氣孔）及傷口侵入幾種情況[15-16]。在本試驗中，感病仙客來的不同器官中都沒有發(fā)現(xiàn)菌絲的特化結(jié)構(gòu)，可能是由于所選取試驗材料已經(jīng)過了感染的最初期，但是在觀察過程中發(fā)現(xiàn)，灰霉病病原菌在葉片、葉柄、花瓣和花梗中的分布特點比較一致，即表皮部位病原菌的密集度最高，表明灰霉病病原菌可能是通過表皮進行侵染，被侵染的葉片中可以觀察到有很多病原體的菌絲是直接通過葉片下表皮的氣孔進入植株組織的。在真菌侵染的表皮部位，都含有大量分生孢子，這種分布既有利于真菌侵染組織細胞，也有利于孢子向外傳播。至于在侵染初期是否產(chǎn)生了其他特化結(jié)構(gòu)，還需進一步觀察和研究。

3.3 灰霉病病原菌在仙客來器官中的傳播

蔣軍喜等對真菌侵染植物的研究發(fā)現(xiàn)，游動孢子在侵入植物時先回縮鞭毛，接著將自身固定在植物表面，然后侵入寄主細胞質(zhì)中[17]。本試驗中有些患病器官的解剖結(jié)構(gòu)顯示，當孢子從表皮進入皮層后,先在皮層細胞內(nèi)定殖并形成大量菌絲，然后進一步向皮層和其他組織細胞擴展，而且真菌菌絲在皮層內(nèi)的擴展方向一般是先橫向后縱向。導管中的分生孢子可沿導管縱向擴展，同時分生孢子還可穿越導管進行橫向擴展，因此，在重病植株體內(nèi)，分生孢子量比較大的導管周圍的細胞中，往往也存在著大量分生孢子，說明病原菌在病株體內(nèi)的縱、橫向擴展，可能是由分生孢子本身不斷生長發(fā)育來完成的，但具體的機制有待于進一步研究。分生孢子縱橫向擴展時，在植株體內(nèi)的某一部位還能因其大量產(chǎn)生而使導管填塞，進而導致花梗和花瓣枯萎死亡。

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