羅明和,汪中文,黃洪波,朱清華,田新朋,白志川,張 偲,張長(zhǎng)生,鞠建華＊

(1.西南大學(xué)園藝園林學(xué)院,重慶 400700;2.中國(guó)科學(xué)院海洋生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510301; 3.廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510301;4.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所,廣東廣州 510301)

海洋鏈霉菌Streptomycessp.SCSIO 1672及其代謝產(chǎn)物水楊酸的分離鑒定

羅明和1,汪中文2,3,4,黃洪波2,3,4,朱清華2,3,4,田新朋2,3,4,白志川1,張 偲2,3,4,張長(zhǎng)生2,3,4,鞠建華2,3,4＊

(1.西南大學(xué)園藝園林學(xué)院,重慶 400700;2.中國(guó)科學(xué)院海洋生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510301; 3.廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510301;4.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所,廣東廣州 510301)

從南海海洋沉積物中分離得到1株海洋放線菌,鑒定為鏈霉菌Streptom ycessp.SCSI O 1672。通過優(yōu)化發(fā)酵條件,采用海蝦生物致死活性和高效液相色譜追蹤,利用有機(jī)溶劑萃取、正相硅膠、反相硅膠等各種色譜層析方法分離出活性化合物,通過波譜數(shù)據(jù)解析出海洋放線菌SCSI O 1672次級(jí)代謝產(chǎn)物中的該活性化合物為水楊酸。

海洋放線菌;鏈霉菌;水楊酸

微生物中的放線菌是藥物的重要來源之一。目前在已發(fā)現(xiàn)的23000個(gè)微生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物中有超過10000個(gè)來源于放線菌,占了近45%。這些活性物質(zhì)具有抗腫瘤、細(xì)胞毒活性、抗感染及免疫抑制等廣泛的生理活性[1]。經(jīng)過近幾十年的研究開發(fā),人們從陸生放線菌中發(fā)現(xiàn)新抗生素的機(jī)率大大降低[2],于是把探索的目光轉(zhuǎn)向海洋。海洋環(huán)境具有低溫、高壓、高鹽等特點(diǎn),這為海洋放線菌發(fā)展獨(dú)特的代謝途徑和機(jī)體防御機(jī)制并產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特的代謝產(chǎn)物提供了條件。近10 a來,人們從海洋放線菌中發(fā)現(xiàn)了大量結(jié)構(gòu)新穎的活性物質(zhì)。例如,Fenical研究小組從Salinispora tropicCNB-392分離得到的salinosporamide A具有很好的選擇性細(xì)胞毒活性[3]; Fernández-Chimeno等[4]從M icrom onosporasp.L-25-ES25-008中分離出的大環(huán)內(nèi)酯類化合物I B-96212對(duì)小鼠淋巴性白血病細(xì)胞P-388有極強(qiáng)抑制活性(IC50=0.0001 mg/L),對(duì)腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)-549、HT-29及MEL-28有明顯的細(xì)胞毒活性(I C50=1 mg/L);Riedlinger等[5]從Verrucosisporasp. AB-18-032中分離得到了一類多環(huán)聚酮類抗生素abyssomicin C,可強(qiáng)烈抑制革蘭陽性菌的生長(zhǎng)。本文對(duì)從中國(guó)南海海洋沉積物中分離純化的240株海洋放線菌發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行海蝦致死活性篩選,發(fā)現(xiàn)編號(hào)為SCSI O 1672的海洋放線菌發(fā)酵粗提物有海蝦致死活性。對(duì)該菌株的16S r DNA進(jìn)行分析,鑒定為鏈霉菌屬(Streptom yces)。采用海蝦毒性為指標(biāo)的活性追蹤方法,對(duì)SCSI O 1672的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究,從中分離得到1個(gè)化合物—水楊酸,并對(duì)該菌株產(chǎn)水楊酸的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了初步篩選優(yōu)化。產(chǎn)水楊酸的鏈霉菌尚未見文獻(xiàn)報(bào)道,本文報(bào)道該菌株的16S rDNA序列分析,發(fā)酵產(chǎn)物中水楊酸的分離鑒定及產(chǎn)水楊酸的培養(yǎng)基的初步篩選。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 海洋放線菌SCSI O 1672分離于中國(guó)南海北部沉積物,菌種保存于中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)采用培養(yǎng)基JNP1(可溶性淀粉5 g/L,魚粉2 g/L,海藻糖2 g/L,幾丁質(zhì)2 g/ L,粗海鹽30 g/L)、JNP2(可溶性淀粉10 g/L,酵母膏4 g/L,蛋白胨2 g/L,粗海鹽30 g/L)和經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基AM2a(可溶性淀粉20 g/L,大豆粉10 g/L,蛋白胨2 g/L,酵母膏5 g/L,粗海鹽30 g/ L)、AM2ab(可溶性淀粉20 g/L,大豆粉10 g/L,蛋白胨2 g/L,酵母膏5 g/L,CaCO32 g/L,NaCl 4 g/L,粗海鹽30 g/L)。培養(yǎng)基配制時(shí)調(diào)pH 7.0～7.2,121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化:將放線菌SCSI O 1672接種于裝有50 mL不同發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,28℃200 r/min培養(yǎng)8 d。放大培養(yǎng)發(fā)酵;種子培養(yǎng):將放線菌SCSI O 1672接種于裝有50 mL AM2a培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,28℃200 r/min培養(yǎng)50 h;發(fā)酵:按10%的接種量將種子接入裝有200 mL AM2ab培養(yǎng)基的1000 mL三角瓶中,28℃200 r/min培養(yǎng)7 d。

1.2.2 HPLC分析 50 mL發(fā)酵產(chǎn)物加80 mL丁酮,攪拌萃取2 h,靜置,取上層丁酮減壓蒸餾至干,加DMSO配成20 mg/mL供生物活性測(cè)試(HPLC分析時(shí),50 mL發(fā)酵物提取物溶解于1 mL甲醇,12000 r/min離心2次)。色譜條件:柱溫:室溫;洗脫劑:A相為乙腈∶水∶冰醋酸(15∶85∶0.1),B相為乙腈∶水∶冰醋酸(80∶20∶0.1),利用程序設(shè)定梯度,0～20 min內(nèi)A相由100%變?yōu)?,20～24 min為100%B相沖洗,流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm,254 nm。取甲醇溶解的發(fā)酵產(chǎn)物各20μL進(jìn)行HPLC(Varian ProStar高效液相色譜儀,配PDA檢測(cè)器)分析,根據(jù)HPLC的吸收峰,收集不同吸收峰的化合物,旋轉(zhuǎn)蒸干后用5μL DMSO溶解。檢測(cè)不同吸收峰化合物的海蝦致死活性,以確定活性峰的tR值及活性峰的峰面積。

1.2.3 活性測(cè)試 海蝦卵的孵化:取海蝦卵100 mg置于500 mL燒杯中,加入含3%海鹽的人工海水,28℃光照、通氣培養(yǎng)24 h;海蝦致死活性測(cè)試:取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加200μL含15個(gè)海蝦幼蟲的人工海水液?？瞻讓?duì)照組加5μL DMSO,樣品組加5μL樣品液。28℃光照培養(yǎng)24 h,在雙目解剖鏡下計(jì)數(shù)海蝦死亡個(gè)體數(shù)目,并計(jì)算死亡率。

1.2.4 化合物的分離分析 將發(fā)酵產(chǎn)物用3500 r/min離心10 min,取上清液用2倍體積的丁酮萃取3次,萃取液經(jīng)減壓濃縮,所得浸膏拌樣上100～200目正相硅膠柱,用氯仿-甲醇梯度洗脫(10∶0～0∶10),所接流分經(jīng)HPLC分析,取氯仿∶甲醇為9∶1時(shí)的流分,上反相硅膠柱,用水-甲醇梯度洗脫(10∶0～0∶10),流分經(jīng)HPLC檢驗(yàn)含活性峰的流分再經(jīng)Sephadex-LH20凝膠柱層析,用甲醇洗脫得化合物1?；衔?經(jīng)Bruker DRX2500核磁共振儀(500/125 MHz,T MS為內(nèi)標(biāo))和LCQ DECA XP液質(zhì)聯(lián)用儀分析,獲得化合物1的氫譜、碳譜和分子量。

1.2.5 放線菌菌株SCSI O 1672的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析 用細(xì)菌16S r DNA序列的通用引物,27F primer(5′-AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3′)和1492R primer(5′-ACGG(CT)TACCTTGTTACGACTT-3′),進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(20μL):DNA模板0.1μL,10×PCR Buffer 2.0μL,dNTPs(各2.5 mmol/L)1.6μL,27F primer(20μmol/L)0.4μL,1492R pri mer(20 μmol/L)0.4μL,Mg2+(25 mmol/L)1.2μL,Taq酶(5 U/μL)0.2μL,DMSO 1.0μL,ddH2O 13.1 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4 min,94℃變性1 min,57℃退火1 min,72℃延伸1.5 min;30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保溫。用凝膠回收試劑盒(Axygen)純化PCR產(chǎn)物,再連接到pGEMT載體(Promega)中,16S r DNA序列由上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)定。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,利用

BLAST應(yīng)用軟件搜索GenBank、EMBL等數(shù)據(jù)庫(kù)

中相關(guān)菌株的16S rDNA序列(http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/)。利用CLUSTAL X[6]進(jìn)行多系列比較分析,并使用MEGA4[7]軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié) 果

2.1 不同培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量及活性

20μL不同培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)HPLC分離后,檢測(cè)收集的不同吸收峰的海蝦毒性,結(jié)果表明AM2a、AM2ab培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物tR=10 min的峰活性最好,24 h海蝦致死率80%。AM2a、AM2ab 2種培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物tR=10 min的峰面積較大,說明AM2a、AM2ab 2種培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物中tR= 10 min的化合物產(chǎn)率比JNP1、JNP2培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率高,見圖1。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:UVλmax205,298 nm;ESI-MS:m/z 137(M-H)-,分子量為138.0,結(jié)合氫譜、碳譜可以推測(cè)其分子式為C7H6O3。1H NMR(500 MHz, DMSO-d6):δH7.77(1H,d,J=7.5 Hz),δH7.45 (1H,m),δH6.89(1H,m),δH6.86(1H,d,J= 7.5 Hz);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6):δC171.8(C-1),δC161.3(C-3),δC134.9(C-5),δC130.7(C-7),δC118.6(C-6),δC116.7(C-4),δC114.1(C-2)?；衔锏臍渥V顯示芳環(huán)1,2-取代的4個(gè)芳香質(zhì)子信號(hào)峰;碳譜顯示1個(gè)共軛羧基信號(hào)峰(δ171.8)、1個(gè)連氧芳環(huán)碳信號(hào)峰(δ 161.3)和另外5個(gè)芳環(huán)碳信號(hào),結(jié)合質(zhì)譜給出的分子量,分析其結(jié)構(gòu)為水楊酸,見圖2。

圖1 不同培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的水楊酸含量的HPLC分析Fig.1 HPLC analyses of the fermentation products under four culture conditions

圖2 化合物1的結(jié)構(gòu)Fig.2 The chemical structure of compound 1

2.3 放線菌菌株SCSI O 1672的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

16S rDNA序列分析表明海洋放線菌SCSI O 1672菌株與鏈霉菌S.daliensisYI M 31724T和S. rangoonensisLMG 20295T的16S rDNA序列相似性較高,分別為98.3%和97.5%,基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明海洋放線菌SCSI O 1672菌株與鏈霉菌S.rangoonensisLMG 20295T為同一分支,支持率為77%(圖3),故鑒定為鏈霉菌Streptom ycessp.SCSI O 1672。

圖3 基于16S rDNA序列NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Neighbour-joining tree based on nearly complete 16S rDNA sequences

3 討 論

水楊酸是生產(chǎn)醫(yī)藥、香料、染料等的重要化工原料。自1943年Strawinski和Stone[9]首先從微生物氧化萘的培養(yǎng)液中分離得到了水楊酸以來,陸續(xù)有微生物產(chǎn)水楊酸的報(bào)道。比如法幼華等[10]得到了2株產(chǎn)水楊酸較穩(wěn)定的菌株,鑒定為Pseudom onasovalisAS1.593和Pseudom onas aeruginosaAS1.860;王樹青[11]用熒光極毛桿菌(Pseudom onasfluofrscens)和腎炎棒狀桿菌(Corynebacterium renals)微生物發(fā)酵制取的水楊酸濃度可達(dá)20 g/L;Ratledge和W inder[12-13]發(fā)現(xiàn)分枝桿菌(M ycobacterium sm egm atis)在缺鐵的培養(yǎng)基中能產(chǎn)水楊酸,并對(duì)各種離子對(duì)水楊酸產(chǎn)量的影響進(jìn)行了研究;另外Shanmugam和Narayanasamy[14]報(bào)道在蘚樣芽胞桿菌中也產(chǎn)水楊酸; Indiragandhi等[15]發(fā)現(xiàn)Acinetobactersp.、Pseudom onassp.和Serratiasp.產(chǎn)水楊酸;Press等[16]報(bào)道粘質(zhì)沙雷菌也產(chǎn)水楊酸;Ratledge和Chaudhry[17]發(fā)現(xiàn)Ther m oactinom yces vulgaris菌的發(fā)酵液體能分離得到水楊酸。盡管如此,目前還沒有發(fā)現(xiàn)從鏈霉菌中分離得到水楊酸的報(bào)道。本研究從海洋鏈霉菌Streptom ycessp.SCSI O 1672的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到了水楊酸,豐富了水楊酸的生產(chǎn)菌株庫(kù),對(duì)該菌株在不同的發(fā)酵培養(yǎng)基中水楊酸的產(chǎn)量進(jìn)行了初步比較研究,發(fā)現(xiàn)用AM2a、AM2ab 2種培養(yǎng)基發(fā)酵,水楊酸的產(chǎn)量相對(duì)較高。

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Isolation and Identification of a Marine Stra in
Streptomyces sp.SCSIO 1672 and Its Metabolite Salicylic Acid

LUO Ming-he1,WANG Zhong-wen2,3,4,HUANG Hong-bo2,3,4,ZHU Qing-hua2,3,4, TIAN Xin-peng2,3,4,BA I Zhi-chuan1,ZHANG Si2,3,4,ZHANG Chang-sheng2,3,4,JU Jian-hua2,3,4
(1.Coll.of Horticult.&Landscape Archit.,SW Uni.,Chongqing400700; 2.Key Lab.of Marine Bio-Res.Sustainable Util.,Guangzhou510301;3.Guangdong Key Lab.of Marine Materia Medica,Guangzhou510301; 4.Ctr.for Marine Microorg.,South China Sea Inst.of Oceanology,Chinese Acad.of Sci.,Guangzhou510301)

A marine actinomycetes strain was isolated and identified as Streptomyces sp.1672 by 16S rDNA sequence analysis.Its fer mentation condition was optimized and its bioactive compound was tested by means of HPLC analysis and bioassay-guided fractionation using brine shrimp toxicity test,and was isolated by solvent extraction,normal and reverse-phase silica gel and other chromatographies.The structure of the bioactive compound was identified as salicylic acid by spectral data analyses.

marine actinomycetes;Streptomyces sp.;salicylic acid

Q939

A

1005-7021(2010)06-0022-05

中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程重要方向項(xiàng)目(KSCX2-Y W-G-065,KZCX2-Y W-JC202,KSCX2-Y W-G-073, KZCX2-EZCX2-EWC-G-12);中國(guó)科學(xué)院南海海洋所領(lǐng)域前沿項(xiàng)目(LYQY200805)

羅明和 男,碩士研究生。主要從事海洋微生物及其活性次級(jí)代謝產(chǎn)物研究。

＊通訊作者。Tel:020-89023028,E-mail:jju@scsio.ac.cn

2010-08-05;

2010-11-05