劉國安,閔建平,張佳佳,頡耀強,丁 蘭,楊 紅

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,蘭州替換為 730070）

香茶菜屬植物中的三萜化合物對脂質(zhì)過氧化和DNA損傷的保護(hù)作用

劉國安＊,閔建平,張佳佳,頡耀強,丁 蘭,楊 紅

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,蘭州替換為 730070）

通過檢測對 H2O2處理的人外周血單個核細(xì)胞的DNA損傷、鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化和pBR322 DNA氧化斷裂的保護(hù)作用,測定了從香茶菜中提取到的4種三萜化合物的抗氧化活性.結(jié)果表明,4種化合物在這3種體系中發(fā)揮著不同的作用.熊果酸在所有體系中保護(hù)作用最強;2α,3β-二羥基-烏蘇-12-烯-28-酸在抑制脂質(zhì)過氧化時活性強,而在抑制單鏈DNA斷裂中作用較弱;其異構(gòu)體2α,3α-二羥基-烏蘇-12-烯-28-酸作用正好相反;齊墩果酸僅在在 H2O2處理的單個核細(xì)胞層DNA損傷中具有微弱保護(hù)作用.

三萜化合物;香茶菜;抗氧化活性;彗星電泳;脂質(zhì)過氧化;DNA鏈斷裂

唇形科植物香茶菜（labiatae isodon）在世界范圍,尤其在中國、日本和韓國種植廣泛.其中許多種類在中國是很重要的中草藥材,被用來作為抗炎、抗腫瘤、清熱解毒和治療無明腫痛的藥物[1],但目前對這些植物藥理學(xué)的研究還非常有限.

抗癌和抗炎癥的機制與抗氧化作用密切相關(guān)[2-3].因此,具有抗氧化性的化合物有望成為抗腫瘤和抗炎癥的候選藥物.單細(xì)胞凝膠電泳也稱彗星電泳技術(shù),近些年被廣泛應(yīng)用并得到不斷發(fā)展.被廣泛用于檢測具有潛在抗氧化作用的物質(zhì)[4].微粒體,尤其是來自光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的部分,因含有大量的多不飽和脂肪酸而易受氧化脅迫的影響,已被廣泛作為氧脅迫和抗氧化研究的一種模型.三萜化合物是香茶菜屬植物（Isodon）中的主要次生代謝物,本文中的4種三萜化合物是從總序香茶菜（Isodon racemosa（Hemsl）Hara）和蘭萼香茶菜（Isodon japonica（Burm.f）.Hara var.galaucocaly x（maxin）Hara.）中分離提純,經(jīng) IR,UV,MS和NMR等多種波普技術(shù)并結(jié)合標(biāo)樣對照鑒定了它們的結(jié)構(gòu)[5-6].本文檢測了它們對經(jīng) H2O2處理的人外周血單個核細(xì)胞中DNA損傷的保護(hù)作用、抑制小鼠肝微粒體中由Fe2+/VC啟動的脂質(zhì)過氧化作用,以及對AAPH誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化斷裂的保護(hù)作用.

1 材料與方法

1.1 受試化合物與試劑

4種分離自香茶菜的三萜化合物為熊果酸（Ursolic acid,UA）、2α,3β-二羥基-烏蘇-12-烯-28-酸 （2α,3β,dihydroxy-urs-12-en-28-oid acid,HU1）、2α,3α-二羥基-烏蘇-12-烯-28-酸 （2α,3α,dihydroxy-urs-12-en-28-oid acid,HU2）和齊墩果酸（Oleanolic acid,OA）.結(jié)構(gòu)見圖1.

AAPH（2,2-偶氮二（2-脒基丙烷）二鹽酸鹽）、瓊脂糖、溴化乙錠、抗壞血酸和蘆丁均購自 Sigma,質(zhì)粒pBR322購自 SABC,其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 對由 H2O2處理的單個核細(xì)胞DNA氧化損傷的保護(hù)作用

將新鮮分離的健康人外周單個核細(xì)胞分別與不同濃度的 4種三萜化合物進(jìn)行孵育,以50μmol/L H2O2于4℃處理 10 min,通過單細(xì)胞凝膠電泳檢測單個核細(xì)胞中的DNA損傷[7].細(xì)胞DNA損傷時因其DNA斷裂,電泳時從核中遷出,呈彗星狀,無損傷的細(xì)胞DNA呈圓形.統(tǒng)計彗星狀細(xì)胞所占的百分率,可反映DNA損傷的程度.

圖1 從香茶菜屬（L abiatae Isodon）植物中分離提取的4種三萜化合物的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of seven triterpenoids from Labiatae Isodon

1.3 脂質(zhì)過氧化的測定

微粒體的制備參照文獻(xiàn)[8].Wistar小鼠饑餓過夜后,斷頸處死并立即取出肝臟,勻漿經(jīng)兩次離心后得微粒體.Lowry法測定蛋白質(zhì)濃度.

將小鼠微粒體和不同濃度三萜化合物加入Fe2+/VC啟動的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)體系.37℃振蕩孵育1 h后,三氯醋酸終止反應(yīng),加入硫代巴比妥酸顯色測定脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛,上清液于532 nm比色.計算不同化合物的半抑制濃度（IC50）.

1.4 測定單鏈DNA氧化斷裂

質(zhì)粒pBR322DNA主要以超螺旋型存在,當(dāng)受到氧化損傷斷鏈時,DNA會先打開一條核酸鏈而解為環(huán)狀,當(dāng)損傷進(jìn)一步加強時,第二條核酸鏈也會被打開而呈線型.實驗時將100 ng的pBR322質(zhì)粒DNA和化合物與10μmol/L自由基引發(fā)劑AAPH混勻,37℃孵育1 h.然后將樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后,用 EB染色,于凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察照相.

1.5 統(tǒng)計數(shù)據(jù)

實驗重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以均值±SD表達(dá).

2 結(jié)果與分析

2.1 對單個核細(xì)胞中H2O2處理的DNA氧化損傷的保護(hù)作用

如圖2所示,細(xì)胞經(jīng) H2O2處理后,DNA損傷的細(xì)胞呈彗星狀.未處理細(xì)胞只有9.6%呈彗星狀,此為單個核細(xì)胞的基礎(chǔ) DNA損傷.當(dāng)用50μmol/L H2O2處理細(xì)胞10 min后,有96.9%的細(xì)胞呈彗星狀.槲皮素（quercetin,Q）是實驗室經(jīng)常使用的抗氧化劑.實驗中作參照.

圖2 單細(xì)胞凝膠電泳圖細(xì)胞DNA損傷（有尾）和無損傷（圓形）（×400）Fig.2 Cells image after single cell micro gel electrophoresis.Cells with（a long tail）and without（circular）damaged DNA

圖3 三萜化合物對 H2O2誘導(dǎo)的人外周血單個核細(xì)胞損傷的保護(hù)作用Fig.3 Protection of triterpenoids from H2O2-induced DNA damage in human peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）

4種化合物的作用從圖3可看出,它們對H2O2處理的DNA氧化損傷具有不同的保護(hù)能力,但作用都不強,均弱于槲皮素.OA與UA的作用相近,HU1和 HU2的作用相近.

2.2 對脂質(zhì)過氧化的抑制作用

4種三萜化合物對小鼠肝微粒體的脂質(zhì)過氧化均具有抑制作用,且存在濃度依賴性.如表1中顯示.其中UA的抑制作用最強,程度與槲皮素相當(dāng);HU1的抗氧化活性明顯強于 HU2,且差異較大（IC50HU1=33.1μmol/L,IC50HU2=103.9μmol/L）;而OA的活性很弱.UA與OA的結(jié)構(gòu)相似,僅因CH3位置不同,UA的抑制作用就遠(yuǎn)高于OA,比后者高20倍.4種三萜化合物對脂質(zhì)過氧化的抑制作用的順序如下:UA>HU1>OA>HU2.

表1 三萜化合物對脂質(zhì)過氧化的半抑制濃度Table 1.Half inhibition concentration（IC50）of triterpenoids on lipid peroxidation

2.3 對鏈狀DNA氧化斷裂的保護(hù)作用

為了進(jìn)一步闡明三萜化合物的抗氧化作用,采用質(zhì)粒pBR322 DNA,由 AAPH誘導(dǎo)斷裂,檢測化合物對無細(xì)胞體系DNA的保護(hù)作用.見圖4.

圖4 三萜化合物對AAPH引起的pBR322DNA斷裂的保護(hù)作用Fig.4 Effects of triterpenoids on pBR322 DNA strand break induced by 10mmol/L AAPH

從圖4（1）中可以清楚地看出,4種化合物對DNA氧化損傷都有一定的保護(hù)作用,并具濃度依賴性.UA作用較強,從25μmol/L起就表現(xiàn)出保護(hù)能力（1,D）,100μmol/L時可完全保護(hù)DNA損傷（1,F）,表現(xiàn)為超螺旋型pBR322質(zhì)粒DNA的條帶和未處理樣（1,A）相同.而OA的作用很弱,在2 000μmol/L時仍只有微弱的保護(hù)效果（1,I）.在圖4（2）中,二種二羥基熊果酸也顯示較強的作用,且 HU2的作用強于 HU1.HU1在200μmol mol/L（2,D）時有明顯的作用,1 600μmol/L時完全保護(hù)（2,G）;而 HU2在400μmol/L時就有了完全的保護(hù)作用（2,J）,但 HU1與 HU2保護(hù)能力比UA弱.因此,對DNA氧化損傷的保護(hù)能力,由強到弱為UA>HU2>HU1>OA.

3 討論

人體的氧化脅迫狀態(tài)與炎癥、癌癥、自身免疫疾病、糖尿病、各種心腦血管疾病、老年性癡呆等有關(guān).炎癥過程涉及激活吞噬細(xì)胞合成和釋放大量的活性氧,從而導(dǎo)致組織和細(xì)胞損傷[9].提高具有抗氧化能力物質(zhì)的攝入可能預(yù)防和降低炎癥的發(fā)生.因此,很多實驗都在探討抗氧化劑作為治療相關(guān)疾病藥物的可能性[10].癌變過程是多步驟的復(fù)雜過程,但與氧化脅迫和炎癥造成的損傷密切相關(guān)[11].因此具有抗氧化和抗炎作用的化合物就有可能作為抗腫瘤藥物.

植物中廣泛存在三萜化合物.常見三萜化合物UA和OA最重要的生物活性是保肝[12],近些年有些研究報告了三萜類化合物的各種生物活性[13-14],但有關(guān)來自香茶菜的三萜化合物抗氧化作用方面的研究未見報道.彗星電泳可用來檢測檢H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞DNA損傷及化合物的保護(hù)作用[7].在脂質(zhì)過氧化體系中,自由基攻擊多不飽和脂肪酸,形成各種細(xì)胞毒醛類物質(zhì).多種病理、生理過程涉及到脂質(zhì)過氧化.AAPH在37℃能產(chǎn)生自由基造成DNA鏈斷裂等生物大分子損傷.

通過對4種三萜化合物在以上3個體系中抗氧化作用的檢測可以看出:UA在3個體系中均具有最強的保護(hù)作用;而其異構(gòu)體OA僅能減輕單核細(xì)胞中 H2O2誘導(dǎo)的DNA氧化損傷,在脂質(zhì)過氧化和pBR322質(zhì)粒DNA氧化損傷中保護(hù)作用都非常弱;比 UA多了一個羥基的 HU1和 HU2在3個體系中作用差異較大,對細(xì)胞的DNA氧化損傷二者只有微弱作用,在脂質(zhì)過氧化中,HU1的作用遠(yuǎn)比 HU2強,約高2倍,而在對無細(xì)胞DNA氧化體系中,作用正好相反.

UA是在這三種測試體系中最有效的抗氧化劑.特別是在抑制脂質(zhì)過氧化中,比其它化合物強5倍多.UA包含一個羥自由基而 HU有兩個,這意味著三萜化合物中僅是羥基的數(shù)目不能決定在這些條件下的抗氧化強度.這與其他抗氧化劑不同,如黃酮類化合物.但是,羥自由基確實是官能團(tuán).如果-OH被乙?；?（AcO型）替換,抗氧化作用明顯減弱（數(shù)據(jù)未顯示）.HU1和 HU2有相同的結(jié)構(gòu)骨架,只是第三位-OH的構(gòu)型不同（見圖1）.在脂質(zhì)過氧化體系中,HU1顯示很強的抑制活性（IC50=33.1）,HU2卻很弱 （IC50=103.9）;而在DNA氧化損傷的保護(hù)中正好相反,這意味著OH-的位置是很重要的,其變化的構(gòu)型在不同的體系中發(fā)揮著不同的作用.UA和 OA唯一不同的是29-CH3.UA中位于19-C,而在 OA中位于20-C.在脂質(zhì)過氧化和DNA鏈斷裂體系UA是最有效的化合物,然而OA是最弱的.所以-CH3,這個從未報道過有抗氧化作用的集團(tuán),其三維位置對其活性也有非常重要的影響.

本文結(jié)果顯示,三萜化合物的抗氧化作用機制復(fù)雜,羥基及-CH3的位置和數(shù)目都可能會影響其對DNA損傷的保護(hù)和抑制脂質(zhì)過氧化的作用,因此三萜化合物的抗氧化機制仍需更深入的研究.

[1]曹露曄,陳子君.藍(lán)萼香茶菜研究進(jìn)展[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2004,3:42-43.

[2]Karbownik M,Lewinski A,Reiter R J.Anticarcinogenic action of melatonin which involve antioxidative processes:comparison with other antioxidants[J].The International Journal of Biochemistry&Cell Biology,2001.33:735-753.

[3]Cerutti P A.Prooxidant states and tumor promotion[J].Science,1985,227:375-378.

[4]Labieniec M,Gabryelak T,Falcioni G.Antioxidant and prooxidant effects of tannins in digestive cells of the freshwater mussel Unio tumidus[J].Mutation Research,2003,539:19-28.

[5]丁 蘭,汪漢卿.總序香茶菜中三萜成分的研究[J].中草藥,2005,36（2）:190-191,223.

[6]王福東,丁 蘭,汪漢卿.藍(lán)萼香茶菜三萜成分的研究[J].中國中藥雜志,2005,30（24）:1929-1932.

[7]LIU G A and Zheng R L.Protection against damaged DNA in the single cell by polyphenols[J].Die Pharmazie,2002,57:852-854.

[8]CAI YJ,Fang J G,Ma L P,et al.Inhibition of free radicalinduced peroxidation of rat liver microsomes by resveratrol and its analogues[J].Biochimica et Biophysica Acta,2003,1637:31-38.

[9]Halliwell B.Oxidants,inflammol/Lation and anti-inflammol/Latory drugs[J].FASEB J.1988,2:2867-2873.

[10]Conner E M and Grisham M B.Inflammol/Lation,free radicals and antioxidants[J].Nutrition,1996,12:274-277.

[11]Surh YJ.Anti-tumor promoting potential of selected spice ingredients with antioxidative and anti-inflammol/Latory:a short review[J].Food and Chemical Toxicology,2002,40:1091-1097.

[12]Saravanan R,Viswanathan P,Pugalendi K V.Protective effect of ursolic acid on ethanol-mediated experimental liver damage in rats[J].Life Science,.2006,78（7）:713-718.

[13]Wang X,Ye X L,Liu R,et al.Antioxidant activities of oleanolic acid in vitro:possible role of Nrf2 and MAP kinases[J].Chemico-Biological Interactions.2010,184（3）:328-37.

[14]Somova L I,Shode F O,Ramnanan P,et al.Antihypertersive,antiatherosclerotic and antioxidant activity of triterpenoids isolated from Olea europaea,subspecies africana leaves[J].Journal of Ethonpharmacology,2003,84:299-305.

Abstract:The antioxidative effects of seven triterpenoids separated from labiatae Isodon were examined by testing their protection against DNA damage in human peripheral blood mononuclear cells induced by H2O2,inhibition of lipid peroxidation and DNA strand breakage.These triterpenoids exerted variably protective effects in these systems.Ursolic acid has the strongest protective effects in all three systems.2α,3β,dihydroxy-urs-12-en-28-oid acid are effective in inhibiting lipid peroxidatian but weak in protection DNA strand breakage.It's isomer 2α,3α,23-trihydroxy-urs-12-en-28-oic-acid showed opposite actions.Oleanolic acid is only effective in DNA damage induced by H2O2in single cell.The relationship between antioxidations and structures are also discussed.

Key words:Triterpenoid;labiatae isodon;antioxdation;comet assay;lipid peroxidation;DNA strand breakage

Inhibitions of lipid peroxidation and protection of DNA damage by triterpenoids fromlabiatae Isodon

LIU Guoan,MIN Jianping,ZHANGJiajia,XIE Yaoqiang,DING Lan,YAN G Hong
（College of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou,730070）

Q946

A

1000-1190（2010）04-0629-04

2010-06-30.

國家自然科學(xué)基金項目（30960464）;甘肅省教育廳研究生導(dǎo)師項目（0901-05）;西北師范大學(xué)知識與科技創(chuàng)新工程項目（NWNU-KJCXGC-03-65）.

＊E-mail:liuguoan@nwnu.edu.cn.