徐守振,王 光,郭艷艷,尹燕博*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東青島 266109;2.青島澳蘭百特生物工程有限公司,山東青島 266101)

隨著山東省養(yǎng)雞業(yè)的持續(xù)發(fā)展,集約化程度的不斷提高,雞主要疾病的發(fā)生與流行也隨之不斷變化。有關(guān)資料表明,傳染病仍是目前危害山東省家禽業(yè)的大敵,約占禽病發(fā)生總數(shù)的75%,尤其是禽流感(AI)、新城疫(ND)和雞傳染性支氣管炎(IB)等病毒性疾病,是危害山東省養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的幾種主要傳染病[1]。近年來,這幾種病毒病呈現(xiàn)出非典型化、多重感染、混合感染和繼發(fā)感染等特點(diǎn),給禽病的診斷與防控工作帶來很多困難。

為明確山東省雞群AI、ND和IB的分布和流行特點(diǎn),本試驗(yàn)采用已建立的RT-PCR診斷技術(shù),對2008年1月至2009年6月山東膠東主要養(yǎng)雞地區(qū)(濰坊、青島和煙臺)送檢的具有呼吸道癥狀雞的病料進(jìn)行了3種病毒的感染情況調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2008年1月～2009年 6月,收集送檢的來自山東省3個主要養(yǎng)雞地區(qū)(濰坊、青島和煙臺)規(guī)模化雞場疑似患有呼吸道疾病的自然發(fā)病雞病料,共計(jì)1 837份。

1.1.2 主要試劑 Tis-飽和酚氯仿為國產(chǎn)試劑;Taq DNA 聚合酶 、dNTPs、DNA Marker DL 2 000均購自寶生物工程(大連)有限公司;總 RNA抽提試劑T rizol購自Invitrogen公司;M-mLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司;RNase inhibitor購自Toyobo公司。

1.1.3 引物 根據(jù)GenBank已發(fā)表的序列,應(yīng)用DNA Star和 DNA Man軟件對 NDV的F基因、IBV的S基因和AIV(H 9)的HA基因序列進(jìn)行同源性分析,應(yīng)用Primer 5.0和Oligo 6.0軟件對各自保守區(qū)設(shè)計(jì)引物,通過http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST對其特異性鑒定表明,3對引物均具有良好的特異性。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)。

1.2 方法

1.2.1 病料的處理 將病料充分勻漿(與PBS 1∶5)后,反復(fù)凍融 3次～4次,12 000 r/min離心15 min,取上清-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒總RNA的抽提 1.5 mL離心管內(nèi)加入600μL Trizol裂解液,后加400μL病料,反復(fù)顛倒幾次混勻。加入400μL氯仿,顛倒混勻,-20℃沉淀10 min。12 000 r/min離心10 min,取上清,再加入800μL異丙醇混勻,-20℃沉淀 30 min。12 000 r/min離心 10 min,棄上清,再加入750 mL/L冷乙醇1 000μL,沖洗1次～2次。晾干后,用無RNase水30μL溶解,-70℃凍存?zhèn)溆没蚣从谩?/p>

1.2.3 cDNA的合成(RT) 病毒RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20μL,其中RNA模板 4μL,5×buffer 4μL,dNTPs(10mmol/L each)2 μL,RNase Inhibitor(10 U/μL)1μL,3種病毒基因序列特異的下游引物(25 pmo l/μL)各 1 μL,M-mLV(200 U/μL)1μL,DEPC 滅 菌 水 7μL,輕輕 吹 打混 勻,1 000 r/min離心1 min,在PCR儀上進(jìn)行以下循環(huán):42℃60 min,98℃5 min,反應(yīng)后瞬間離心,反應(yīng)液-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 目的基因片段的PCR擴(kuò)增 采用山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已建立的PCR反應(yīng)體系[2]:模板 2.0μL,10×PCR buffer 3.0μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2.5μL,M gC l2(25 mm ol/L)4.0μL,3種序列的上下游引物(25 pmol/μL)各 0.5μL,Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL,加 H 2 O 至30μL,吹打混勻后瞬時(shí)離心。PCR反應(yīng)參數(shù):94.5℃預(yù)變性2 min;94.5℃30 s;55℃40 s;72℃1.5 min,共35個循環(huán);72℃再延伸9 min。反應(yīng)結(jié)束后取5μLPCR產(chǎn)物在15 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳,在凝膠成像系統(tǒng)上觀察。

1.2.5 調(diào)查結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析 按照疾病在不同時(shí)間段,不同地區(qū)的發(fā)生和流行情況以及混合感染等情況,對調(diào)查結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表 1 PCR引物Table1 Primers for PCR

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用建立的 RT-PCR方法對2008年1月份至2009年6月份期間來自濰坊、青島和煙臺三地區(qū)的1 837份病料進(jìn)行了檢測,結(jié)果從227份病料中擴(kuò)增出NDV預(yù)期的目的基因片段,從226份病料中擴(kuò)增出IBV預(yù)期的目的基因片段,從755份病料中擴(kuò)增出A IV(H 9)預(yù)期的目的基因片段,病料擴(kuò)增片段均與陽性對照所擴(kuò)增出的片段完全一致。部分病料擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖1。

圖1 部分病料的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 The electropho resis results of RT-PCR productsof some samples

2.2 NDV、IBV和A IV(H 9)總感染情況

送檢的1 837份病料中可檢出NDV、IBV和AIV(H 9)中的一種或多種,陽性率高達(dá)65.76%,其中NDV平均陽性率為 12.36%,IBV陽性率為12.30%,A IV(H 9)陽性率為41.10%,說明該段時(shí)間NDV、IBV和A IV(H 9)3種病毒在膠東主要養(yǎng)雞地區(qū)中普遍存在,且以AIV(H 9)感染最為嚴(yán)重(表2)。

表2 NDV、IBV和A IV(H 9)的檢測結(jié)果Table2 The detection resu lts of NDV,IBV and A IV(H 9)

2.3 不同地區(qū)各病毒感染情況

2008年1月至2009年6月期間,濰坊地區(qū)共送檢病料396份,NDV、IBV和AIV(H 9)的陽性率分別為11.87%、3.54%和42.42%;青島地區(qū)共送檢病料996份,NDV、IBV和A IV(H 9)的陽性率分別為13.45%、17.37%和44.08%;煙臺地區(qū)共送檢病料445份,NDV、IBV和A IV(H9)的陽性率分別為10.33%、8.76%和33.26%(表3)。從檢出結(jié)果可以看出,三地區(qū)的雞場3種病毒的感染比較普遍,但各地區(qū)不同病毒感染的情況稍有差異,青島地區(qū)NDV、IBV 和AIV(H 9)的陽性率均為最高,濰坊地區(qū)IBV的陽性率最低,煙臺地區(qū)AIV(H9)陽性率最低。

表3 不同地區(qū)3種病毒的檢出結(jié)果Table3 The detection results of three viruses in different regions

2.4 不同月份各病毒感染情況

同一年的不同月份3種病毒感染情況有所不同,2008全年3種病毒感染的高峰都集中在下半年,其中7月NDV陽性率最高為32.00%,9月IBV陽性率最高為26.88%,11月AIV(H9)陽性率最高為50.00%;2009上半年中,5月份NDV陽性率最高為14.29%,4月份IBV陽性率最高為19.44%,2月份AIV(H 9)陽性率最高為62.20%(表4)。總體看來,寒冷月份3種病毒的感染率都相對較高,說明3種疾病的發(fā)生與氣溫有一定關(guān)系。

送檢病料中,2008全年3種病毒的陽性率合計(jì)為64.64%,其中2008年上半年陽性率為54.72%,2008年下半年陽性率為73.22;2009上半年3種病毒的陽性率為68.05%。2008下半年NDV、IBV和A IV(H 9)陽性率較2008年上半年都有所升高,以A IV(H 9)升高最為顯著;2009年上半年NDV陽性率較2008年上半年下降,而IBV和AIV(H9)發(fā)病率上升,且以A IV(H 9)發(fā)病率上升最為顯著(圖2)?？傆^來看,在2008年1月至2009年6月期間AIV(H 9)陽性率一直處于上升趨勢中,尤其要引起足夠重視。

表4 不同月份3種病毒的檢出結(jié)果Table4 The detection resu lts of three viruses in differentmon ths

圖2 不同時(shí)段3種病毒陽性率對比圖Fig.2 The comparison of positive rate of th ree viruses in different period of time

2.5 3種病毒混合感染情況

送檢病料中NDV、IBV和AIV(H 9)混合感染的現(xiàn)象比較普遍,二重和三重感染陽性率合計(jì)達(dá)11.00%。二重感染陽性率為10.13%,其中NDV+IBV占1.58%,NDV+A IV(H9)占3.92%,IBV+A IV(H 9)占4.63%;NDV+IBV+A IV(H 9)三重感染陽性率為 0.87%?；旌细腥局?以 IBV+AIV(H 9)二重混合感染最為嚴(yán)重(表5)。

表5 3種病毒混合感染的檢測結(jié)果Table5 The detection results of co-infectionsof th ree viruses

3 討論

雞病毒病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法很多,常用的有病毒分離鑒定、血凝(抑制)試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、免疫熒光和ELISA等方法,這些方法存在操作技術(shù)復(fù)雜,周期較長,特異性低、敏感性差等缺點(diǎn),不易于大規(guī)模普查,在發(fā)生急性疫情或混合感染、隱性感染時(shí),往往不能獲得滿意的效果[3]。PCR技術(shù)具有敏感性高、特異性好、快速簡便等特點(diǎn),尤其對微量的樣品或難以用組織培養(yǎng)的方法獲得多量病毒樣品的檢測具有一定的優(yōu)勢,已廣泛用于許多病毒和細(xì)菌的快速診斷與流行病學(xué)調(diào)查[4]。本次調(diào)查應(yīng)用建立的RT-PCR技術(shù)對山東濰坊、青島和煙臺地區(qū)的規(guī)模雞場1 837份病料進(jìn)行了NDV、IBV和AIV(H 9)檢測調(diào)查。結(jié)果表明,所建立的PCR技術(shù)具有快速、敏感、特異、穩(wěn)定等特點(diǎn),用該技術(shù)對這些疾病進(jìn)行早期診斷、流行病學(xué)調(diào)查,可為雞傳染病的防控提供重要依據(jù)。

本調(diào)查通過近一年半的時(shí)間,對山東膠東3個主要養(yǎng)雞地區(qū)規(guī)模雞場送檢的1 837份病例進(jìn)行了3種病毒感染情況調(diào)查,發(fā)現(xiàn)商業(yè)雞群中該3種病毒性疾病均有不同程度的發(fā)生和流行,陽性率由高到低依次為AIV(H 9)、IBV和NDV。2008年1月至2009年6月期間,濰坊、青島和煙臺三地區(qū) AIV(H 9)的感染率可達(dá)48.34%,表明A IV(H 9)在山東省主要養(yǎng)雞地區(qū)普遍存在,且處于高發(fā)病狀態(tài)。AIV(H 9)雖然一般為低致病性,但在我國雞群分布廣泛,發(fā)病率一直居高不下,造成宿主的免疫抑制及與其他致病微生物產(chǎn)生協(xié)同作用等,給養(yǎng)禽業(yè)帶來危害[5-6]。雖然山東省3個地區(qū)雞場3種病毒的感染和流行普遍存在,但各地區(qū)的流行情況稍有差異。青島地區(qū)NDV、IBV和AIV(H 9)的陽性率均為最高,分別為 13.45%、17.37%和 44.08%;濰坊地區(qū)IBV的陽性率最低,煙臺地區(qū)AIV(H 9)陽性率最低。這可能與各地區(qū)3種疾病既往的流行病史、飼養(yǎng)管理和預(yù)防控制等措施密切相關(guān)。濰坊、青島和煙臺三地區(qū)在地域上緊密相連,而且交流頻繁有關(guān),但該3種病毒感染是否與地域有直接的關(guān)系,還有待進(jìn)一步研究。從送檢病料的發(fā)病月份看,三種疾病的發(fā)生與季節(jié)有一定關(guān)系,不同月份3種疾病的發(fā)生和流行稍有差異。寒冷月份送檢的病料最多,而且三種病毒的陽性率都相對較高,說明寒冷季節(jié)是雞呼吸道疾病的多發(fā)季節(jié),尤其以AIV(H 9)為甚。2008下半年NDV、IBV和AIV(H 9)陽性率較2008年上半年都有所升高,以A IV(H 9)升高最為顯著;2009年上半年NDV陽性率較2008年上半年下降,而 IBV和A IV(H 9)發(fā)病率上升,且以AIV(H 9)發(fā)病率上升最為顯著。尤其要引起足夠重視的是2008年1月至2009年6月期間AIV(H 9)陽性率一直處于上升趨勢中,該病毒是否在2009下半年繼續(xù)處于上升的流行趨勢中這應(yīng)引起我們的足夠警惕,應(yīng)采取有效措施防患于未然。本試驗(yàn)調(diào)查結(jié)果初步揭示了ND、IB和AI(H9)是造成山東省膠東地區(qū)當(dāng)前雞場呼吸道疾病經(jīng)濟(jì)損失的主要疾病,這為有效預(yù)防和控制膠東地區(qū)雞場的主要疫病提供科學(xué)依據(jù)。

NDV、IBV和A I(H 9)是當(dāng)前規(guī)模雞場的主要疫病,不但可以單一感染,還可以混合感染或繼發(fā)感染[7]。送檢病料中NDV、IBV和AIV(H 9)混合感染的現(xiàn)象比較普遍,二重、三重感染的陽性率合計(jì)達(dá)11.00%,其中二重感染、三重感染陽性率分別為10.13%和 0.87%,以 IBV+AIV(H 9)和 NDV+A IV(H9)二重感染最為常見,NDV+IBV+AIV(H 9)三重感染也有存在。引起疾病混合感染的原因很多,其中一個很重要原因是一種免疫抑制性疾病的發(fā)生可對另一種或多種免疫抑制性疾病的發(fā)生有促進(jìn)作用。AI和ND能引起雞一定程度的免疫抑制,免疫系統(tǒng)發(fā)育未成熟的雛雞感染后,損傷機(jī)體的免疫系統(tǒng),增加了其他病原體的感染力和致病力,造成混合感染的嚴(yán)重后果,不但直接影響雞群的生長發(fā)育,加劇病雞的臨床癥狀,提高了發(fā)病率和死亡率,導(dǎo)致致病性細(xì)菌繼發(fā)感染,而且使疫苗免疫效果不佳甚至免疫失敗,使雞病更加復(fù)雜和嚴(yán)重,加大了防控的難度[8-10]。因此,應(yīng)該針對山東省膠東三地區(qū)雞的3種病毒混合感染流行現(xiàn)狀采取綜合性的防控措施。

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