陳海濱

(福建省藥品檢驗(yàn)所,福建 福州 350001)

腎舒顆粒(無糖型)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

陳海濱

(福建省藥品檢驗(yàn)所,福建 福州 350001)

目的：建立腎舒顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：用TLC對處方中白花蛇舌草、大青葉、甘草、黃柏進(jìn)行定性鑒別；用HPLC測定黃柏中鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果：定性鑒別分離度好，專屬性強(qiáng)。含量測定鹽酸小檗堿在0.01～1.28μg具有良好的線性關(guān)系,r=0.999 9。結(jié)論：該方法簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于腎舒顆粒(無糖型)的質(zhì)量控制。

腎舒顆粒；白花蛇舌草；大青葉；甘草；黃柏；鹽酸小檗堿

腎舒顆粒由白花蛇舌草、大青葉、瞿麥、萹蓄、海金沙藤、淡竹葉、地黃、黃柏、茯苓、甘草等10味中藥組成。具有清熱解毒，利水通淋功能，用于尿道炎，膀胱炎，急慢性腎盂腎炎。腎舒顆粒全國共有4個(gè)生產(chǎn)批準(zhǔn)文號，3家企業(yè)生產(chǎn)，原標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》第9冊(標(biāo)準(zhǔn)編號：WS3-B-1752-94),僅有兩個(gè)化學(xué)鑒別項(xiàng)。本次研究購得兩個(gè)企業(yè)、不同批號的無糖型樣品多批，力爭用同一標(biāo)準(zhǔn)更好控制同一成藥質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日本島津LC-2010CHT高效液相色譜儀，包括真空脫氣機(jī)，四元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測器，LC Solution工作站，Milli-QA 超純水器(Millipore)。

1.2 試藥

腎舒顆粒(無糖型)(廈門中藥廠，批號080401，080402，080501；四川迪康科技藥業(yè)股份有限公司成都迪康制藥公司，批號071003，071004，071101)；缺白花蛇舌草、缺大青葉、缺甘草、缺黃柏的陰性對照品(廈門中藥廠)。

白花蛇舌草對照藥材(批號121183-200402)，甘草對照藥材(批號120904-200512)，關(guān)黃柏對照藥材(批號120937-200506)，黃柏對照藥材(批號121510-200703)，齊墩果酸對照品(批號110709-200505)，靛玉紅對照品(批號0717-9402)，鹽酸小檗堿對照品(批號110713-200609)，均購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 白花蛇舌草、甘草薄層鑒別

取本品10g，加甲醇80mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL、鹽酸1mL，超聲使溶解，置水浴上加熱回流1h，取出，冷卻，用二氯甲烷振搖提取2次(25mL/次)，合并二氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取白花蛇舌草、甘草對照藥材各1g，分別加甲醇25mL，同法制備，殘?jiān)謩e加甲醇2mL使溶解，作為對照藥材溶液。另取齊墩果酸對照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。取缺白花蛇舌草、缺甘草兩種陰性腎舒顆粒樣品，同供試品溶液提取方法制成陰性對照品溶液。吸取供試品溶液4～8μL，對照品及對照藥材溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G預(yù)制薄層板上，使成條狀，以甲苯-醋酸乙酯-醋酸(48∶16∶2)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與甘草對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的條斑；置紫外燈(365nm)下檢視，在與齊墩果酸對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光條斑，見圖1。

A.日光 B.紫外光燈(365nm)1.缺甘草腎舒顆粒(無糖型)陰性對照品 2.甘草對照藥材(批號120904-200512) 3～5.腎舒顆粒(無糖型)(批號080401，080402，080501) 6～8.腎舒顆粒(無糖型)(批號071003，071004，071101) 9.缺白花蛇舌草腎舒顆粒(無糖型)陰性對照品 10.白花蛇舌草對照藥材(批號121183-200402) 11.齊墩果酸對照品(批號110709-200505)圖1 腎舒顆粒中白花蛇舌草、甘草薄層色譜鑒別

2.2 大青葉薄層鑒別

取本品20g，研細(xì)，加甲醇80mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL，超聲使溶解，用二氯甲烷振搖提取2次(25mL/次)，合并二氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取靛玉紅對照品，加二氯甲烷制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。再取缺大青葉的腎舒顆粒樣品，同供試品溶液提取方法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-二氯甲烷-丙酮(5∶4∶1)為展開劑，展開，展距約5cm，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，見圖2。

1.靛玉紅對照品(批號0717-9402) 2.缺大青葉腎舒顆粒(無糖型)陰性對照品 3～5.腎舒顆粒(無糖型)(批號080401，080402，080501) 6～8.腎舒顆粒(無糖型)(批號071003，071004，071101)圖2 腎舒顆粒中靛玉紅薄層色譜鑒別

2.3 黃柏薄層鑒別

分別取關(guān)黃柏、黃柏對照藥材各0.5g，加甲醇10mL，加熱回流15min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。另取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。再取缺黃柏的腎舒顆粒樣品，同供試品溶液提取方法，制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取對照品及對照藥材溶液各2μL，陰性對照品及“2.2項(xiàng)下”的供試品溶液1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，分別以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)，展開，取出，晾干，置紫外燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見圖3。

1～3.腎舒顆粒(無糖型)(批號071003，071004，071101) 4～6.腎舒顆粒(無糖型)(批號080401，080402，080501) 7.缺黃柏腎舒顆粒(無糖型)陰性對照品 8.關(guān)黃柏對照藥材(批號120937-200506) 9.黃柏對照藥材(批號121510-200703) 10.鹽酸小檗堿對照品(批號110713-200610)圖3 腎舒顆粒中黃柏薄層色譜鑒別

3 含量測定

3.1 色譜條件和測定方法

采用Welch Materirals XB-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；以0.033mol·L-1的磷酸二氫鉀溶液-乙腈(72∶28)為流動(dòng)相；柱溫：35℃；流速：1.0mL·min-1，測定波長：265nm；進(jìn)樣量(自動(dòng)進(jìn)樣)：供試品溶液20μL，對照品溶液10μL。

3.2供試品溶液制備

取研細(xì)的樣品0.3g，精密稱定，精密加入流動(dòng)相25mL，稱重，超聲提取20min(功率300W，頻率40kHZ)，放冷至室溫，用流動(dòng)相補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.3 對照品溶液制備

取經(jīng)105℃干燥5h的鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相配制成每1mL約含0.01mg的溶液，即得。

3.4 線性關(guān)系考察

精密稱取105℃干燥5h的鹽酸小檗堿對照品適量，加流動(dòng)相溶解，制成對照品母液(0.128 1mg·mL-1)，分別精密吸取0.4，2，5，10，25，50mL，置50mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。精密吸取10μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積與對照品進(jìn)樣量(μg)進(jìn)行回歸，得線性方程Y=4 434 060.30X-16 312.44(r=0.999 9)，線性范圍為0.01～1.28μg。

3.5 專屬性試驗(yàn)

取缺黃柏陰性樣品0.3g，按供試品溶液的制備方法制得陰性樣品溶液，測定，結(jié)果見圖4，缺黃柏腎舒顆粒(無糖型)陰性對照品溶液在與對照品相應(yīng)的保留時(shí)間處無峰出現(xiàn)，表明方中其他各味藥材不干擾鹽酸小檗堿的測定。

A.鹽酸小檗堿對照品 B.腎舒顆粒(無糖型)樣品(批號080401) C.缺黃柏腎舒顆粒(無糖型)陰性對照品圖4 鹽酸小檗堿對照品、腎舒顆粒(無糖型)及缺黃柏陰性樣品HPLC圖

3.6重復(fù)性試驗(yàn)

取腎舒顆粒(無糖型)樣品(批號080401)，按供試品溶液提取方法平行制備6份，依上述色譜條件進(jìn)行測定并計(jì)算鹽酸小檗堿的含量，平均含量為3.94mg/袋，RSD=1.89%(n=6)。

3.7 耐用性試驗(yàn)

3.7.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液在0，4，8，12，16，20，24h后按上述色譜條件測定樣品中鹽酸小檗堿峰面積，結(jié)果RSD=0.40%。

3.7.2 在一定范圍內(nèi)改變流動(dòng)相比例對色譜圖的影響 選用Welch Materirals XB-C18色譜柱試驗(yàn)，分別采用流動(dòng)相乙腈-0.033mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(26∶74)、(28∶72)、(30∶70)，結(jié)果鹽酸小檗堿峰與相鄰的雜質(zhì)峰均能達(dá)到良好的分離，見圖5。

3.7.3 不同品牌色譜柱對實(shí)驗(yàn)的影響 選用Welch Materirals XB-C18色譜柱，SHIMUDZU島津柱子，對同一份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行含量測定，結(jié)果樣品與對照品均獲得良好的峰形，見圖6，鹽酸小檗堿平均含量為0.37mg·g-1，RSD=1.68%。

3.7.4 不同儀器對實(shí)驗(yàn)的影響 選用同一色譜柱Welch Materirals XB-C18色譜柱，對同一份供試品溶液，分別在島津2010CHT高效液相，Agilent 1100液相，按正文色譜條件進(jìn)行含量測定，結(jié)果樣品與對照品均獲得良好的峰形，見圖7，平均含量0.38mg· g-1，RSD=1.36%。

圖5 不同比例流動(dòng)相的HPLC圖A.乙腈-0.033 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(26∶74) B.乙腈-0.033 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(28∶72) C.乙腈-0.033 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(30∶70)

A.Welch Materirals XB-C18 B.SHIMUDZU島津柱子圖6 不同品牌色譜柱HPLC圖

A.島津2010 CHT B.Agilent 1100圖7 同一品牌色譜柱不同儀器HPLC圖

3.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量(0.392mg·g-1,3.94mg/袋)的腎舒顆粒(無糖型)樣品(批號080401)9份，每份約0.15g，采用加樣回收，分別精密加入鹽酸小檗堿對照品溶液(0.012 6mg·mL-1)4,5,6mL，按供試品溶液方法，每個(gè)梯度平行制備3份，測定，結(jié)果見表1。

表1 鹽酸小檗堿加樣回收率試驗(yàn)

3.9 樣品含量測定

取6批樣品按上述色譜條件，測定鹽酸小檗堿含量，結(jié)果見表2。

表2 腎舒顆粒(無糖型)鹽酸小檗堿的含量測定 mg/袋(mg·g-1)

4 討論

4.1 薄層色譜鑒別

2.1項(xiàng)下白花蛇舌草薄層色譜鑒別中，廈門中藥廠生產(chǎn)的腎舒顆粒(無糖型)斑點(diǎn)顏色明顯比四川迪康科技藥業(yè)股份有限公司成都迪康制藥公司的清晰，通過對二者制法的比較，估計(jì)與兩藥廠醇沉密度不同所致，該步驟有可能使兩家藥廠所生產(chǎn)出的腎舒顆粒在含量上有所不同。

黃柏、關(guān)黃柏薄層的鑒別中，黃柏為常用皮類藥材，有關(guān)黃柏與川黃柏之分，近來研究發(fā)現(xiàn)，黃柏與關(guān)黃柏不僅其主要有效成分小檗堿含量有明顯差異，而且輔助成分黃柏堿等也存在較大差異[1-3]，為確證處方所用為關(guān)黃柏還是川黃柏，采用中國藥品生物制品檢定所提供的兩個(gè)對照藥材進(jìn)行試驗(yàn)，同時(shí)具有大小相近的鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的兩個(gè)黃色熒光斑點(diǎn)的是關(guān)黃柏；只有鹽酸小檗堿的黃色熒光斑點(diǎn)，或雖然有鹽酸巴馬汀黃色熒光斑點(diǎn)，但極小或隱約可見的是黃柏[4]。在同一張薄層板上，相同取樣量的黃柏與關(guān)黃柏的鹽酸小檗的黃色熒光斑點(diǎn)，前者明顯比后者大而且亮[5]，結(jié)果兩個(gè)生產(chǎn)企業(yè)所用均為川黃柏。

白花蛇舌草為處方中君藥，在【含量測定】指標(biāo)成分選擇中曾擬對其進(jìn)行含量測定的考察。查閱大量參考文獻(xiàn)[6-9]，白花蛇舌草中含豆甾醇、谷甾醇、熊果酸、齊墩果酸、香豆酸等成分。國外報(bào)道其中還含有蒽醌類、環(huán)烯醚萜類成分。僅熊果酸、齊墩果酸有中國藥品生物制品檢定所提供對照品。因此對該兩種成分進(jìn)行含量測定摸索。先用薄層法進(jìn)行預(yù)試，供試品溶液未經(jīng)過酸水解時(shí)，四川迪康科技藥業(yè)股份有限公司成都迪康制藥公司的樣品未能檢出齊墩果酸、熊果酸，只有經(jīng)過酸水解后，兩個(gè)生產(chǎn)企業(yè)樣品可檢出齊墩果酸。但考慮該兩個(gè)成分非白花蛇舌草獨(dú)有成分，在中藥材中非特征性成分，且需酸水解后測定，缺乏一定的專屬性，故只對該藥材進(jìn)行薄層色譜鑒別。

4.2 流動(dòng)相選擇

采用《中國藥典》黃柏藥材[10]液相條件：乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50)，結(jié)果鹽酸小檗堿峰與雜質(zhì)峰分離較差。用HPLC測定鹽酸小檗堿含量所用的流動(dòng)相有多種[11-15]，摸索用乙腈-0.05mol·L-1磷酸二氫鉀、乙腈-0.05mol·L-1磷酸二氫鉀(43∶57)(每1 000mL中加入十二烷基磺酸鈉1.7g)，0.033mol·L-1的磷酸二氫鉀溶液-乙腈(60∶40)，乙腈-磷酸二氫鈉(0.025mol·L-1)-十二烷基硫酸鈉(0.025mol·L-1)(50∶25∶25)，乙腈-水(每 100mL加 0.26mL磷酸、0.5mL三乙胺與0.05g十二烷基硫酸鈉)(46∶54)等5種流動(dòng)相，結(jié)果選用0.033mol· L-1的磷酸二氫鉀溶液-乙腈(60∶40)，系統(tǒng)適用性較好，且配制簡便。

4.3 鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率

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StudyonQualitySpecificationofShenshuGranule

Chen Haibin

(Fujianinstitutefordrugcontrol，F(xiàn)uzhouFujian350001,China)

Objective:To establish the quality standard for Shenshu Granule.Methods:HedyotisdiffusaWilld.,IsatisindigoticaFort.,Glycyrrhiza,PhellodendronchinenseSchneid. in Shenshu Keli were identified by TLC. The content ofPhellodendronchinenseSchneid.was determined by HPLC.Results: The study showed that the dentification by TLC was distinct and highly specific. The linear range of berberine hydrochloride was 0.01～1.28μg(r=0.999 9).Conclusion: The method for identification was simple, accurate, realizable and reproducible. It can be used for quality control of Shenshu Keli.

Shenshu Granule；HedyotisdiffusaWilld.；IsatisindigoticaFort.；Glycyrrhiza；PhellodendronchinenseSchneid.；Berberine Hydrochloride

*陳海濱，E-mail：chenhaibin1997@126.com

2010-03-24)