張國海，王啟釗，張景紅，許瑞安,2

1 華僑大學分子藥物學研究所，泉州 362021

2 分子藥物教育部工程研究中心，泉州 362021

綜 述

microRNA調控的靶向性病毒載體在基因治療中的應用

張國海1，王啟釗1，張景紅1，許瑞安1,2

1 華僑大學分子藥物學研究所，泉州 362021

2 分子藥物教育部工程研究中心，泉州 362021

安全、有效、具有靶向性的病毒載體是基因治療藥物在臨床上得以應用的關鍵。microRNA是一類單鏈、內源性的轉錄后調控小分子，它的發(fā)現(xiàn)為開發(fā)具有靶向性調控能力的病毒載體提供了新的研究方法。以下在介紹microRNA調節(jié)病毒載體靶向性原理的基礎上，著重介紹 microRNA在清除復制能力病毒的污染、消除轉基因特異性免疫、增強腫瘤靶向性基因治療、開發(fā)活體疫苗等領域的應用。

基因治療，microRNA，病毒載體，靶向性調控

Abstract:A safe and effective targeting viral vector is the key factor for successful clinical gene therapy. microRNA, a class of small, single-stranded endogenous RNAs, act as post-transcriptional regulators of gene expression. The discovery of these kind regulatory elements provides a new approach to regulate gene expression more accurately. In this review, we elucidated the principle of microRNA in regulation of targeting viral vector. The applications of microRNA in the fields of elimination contamination from replication competent virus, reduction of transgene-specific immunity, promotion of cancer-targeted gene therapy and development of live attenuated vaccines were also discussed.

Keywords:gene therapy, microRNA, viral vector, targeting regulation

病毒載體因具有轉染效率高、表達時間長、感染細胞廣泛等優(yōu)勢，在基因治療的載體選擇中一直備受關注[1]。但是在將外源基因導入細胞的過程中，病毒載體本身以及編碼基因產物的非特異性表達常常引起免疫反應，以致封閉目的基因的表達而使其失去治療效果[2]。因此開發(fā)安全、有效、靶向性的病毒載體是基因治療取得進一步成功的關鍵。作為轉錄后調控分子，microRNA在調節(jié)病毒載體靶向性的成功應用[3-6]，使基因治療在造福人類的道路上又向前邁進了堅實的一步。它不但能從根源上解決具有復制能力病毒的污染問題，還能夠消除轉基因特異性免疫，開發(fā)腫瘤特異性基因治療，拓展基因治療的新領域。本文就 microRNA調節(jié)病毒載體靶向性在基因治療中的應用進展作一綜述。

1 基于microRNA的靶向性病毒載體的構建

microRNA調節(jié)病毒載體的靶向性源于它作為轉錄后小分子調節(jié)物的作用機理。它主要通過 5′端的前 2～8個核苷酸的種子序列 (Seed sequence) 識別 mRNA 3′端非翻譯區(qū) (3′UTR) 來實現(xiàn)在轉錄后水平上調節(jié)基因的表達[7]。因此將含有特定microRNA靶向元件 (miRNA target element，miRTE) 的靶盒置于目的基因或病毒載體關鍵元件的3′UTR區(qū)，就能通過內源性的microRNA來調控目的基因的表達，達到在轉錄后水平上調節(jié)病毒載體的靶向性[6]。

圖1 miRTE-病毒載體的構建Fig.1 Construction of viral vector containing miRTE. (A) MicroRNA Eliminated contamination of replication competent virus. If there were replication competent virus during vector production, the replication competent virus can’t replicate by interfering capsid genes expression in targeted tissue. (B) Tissue-specific expression of transgenes. When the viral vectors transfect the unwanted tissue or cell, transgene can’t express under the interference of miRTE associated microRNA. First Incorporation four tandem copies of a single miRTE (red) into the viral vector helper plasmid (A) or 3′UTR of a function gene (B), then the viral plasmid and the packaging plasmids co-infect the packaging cell, after the encapsidation of viral DNA, viral vectors containing miRTE are harvested.

目前miRTE-病毒載體的構建主要分為兩類：一類是將特定的miRTE克隆到病毒包裝所需輔助質粒中 (圖 1A)，以達到在以特定組織為靶器官的基因治療中解決具有潛在復制能力病毒的污染問題；另一類是將特定的miRTE克隆到目的基因的3′UTR (圖1B)，以實現(xiàn)轉基因產物的細胞或組織特異性表達。在這兩類病毒載體的構建中，miRTE數量和種類的選取至關重要。已有文獻報道將4個相同的miRTE串聯(lián)置于載體上能達到最佳的調控效果[5]，低于或超過 4個都會減弱其調控效果[8]。miRTE種類的選取則主要取決于其對應的內源性 microRNA的數量和分布情況。理想的microRNA應在數量上占優(yōu)勢以達到調控的有效性，同時在分布上具有特異性 (表1)，以達到調控的靶向性。如肝組織特異性 microRNA、miR-122a因在體內的含量非常高，且僅在肝臟、大腦等少數組織中表達，故常常被用于調控病毒載體的靶向性[10-12]；或者在病理情況下變化較明顯的microRNA，如在腫瘤中起抑癌作用的 microRNA，在正常組織中大量表達在癌組織中卻明顯下調，據此可以構建靶向于癌組織的病毒載體[13-14]。

表1 組織特異性microRNA表達[6,9-12]Table 1 Tissue-specifc microRNA expression[6,9-12]

miRTE-病毒顆粒包裝的基因組中含有外源性的miRTE序列，這種序列對于病毒的包裝效率和基因的表達是否有影響呢？本實驗室的體內外實驗研究顯示，這種外源性的miRTE序列對病毒載體的包裝和基因的表達幾乎沒有影響[15]。在生產AAV所需的衣殼蛋白輔助質粒中加入肝組織特異性的 miR-122和造血特異性的 miR-142-3p的 miRTE序列后，與原輔助質粒相比，生產的 rAAV病毒顆粒無論在產量還是感染效率上都沒有明顯的區(qū)別，這說明加入miRTE序列后對病毒包裝和基因表達不會產生顯著影響。肌肉內注射rAAV-LacZ經X-gal染色發(fā)現(xiàn)，兩種輔助質粒產生的病毒載體產生的轉基因數量在肌肉組織內類似；在肝臟中，由新型輔助質粒包裝成的rAAV-FIX (凝血因子IX) 在開始的4～6周內表達逐漸增加，并達到1 000 ng/mL的峰值，與傳統(tǒng)的rAAV載體所表達出來的效能基本一致[15]。

2 microRNA靶向性調控能力在基因治療中的應用

2.1 從根源上解決具有復制能力病毒的污染問題

用于基因治療的病毒載體都是經過遺傳改造后只保留了病毒復制所需順式元件的改造載體，對人體無害[1]。但是在病毒包裝過程中，由于同源重組或非同源重組的原因會產生具有復制能力的病毒，致使在治療過程中引發(fā)免疫反應而關閉功能基因的表達[16]。為了降低具有復制能力病毒的污染，本實驗室[15]對含有miR-122和miR-142-3p miRTE的新輔助質粒產生的 rAAV載體進行了細胞學研究。實驗表明，新型輔助質粒攜帶的Cap基因能在293細胞中穩(wěn)定表達，且新體系生產的病毒無論在數量上還是品質上都和原來相似。在肝細胞系中Cap基因的表達急劇減少，在肝臟中，99.9%的Cap基因表達受到抑制，蛋白印記的方法未檢測到Cap基因的表達產物。目前本課題組正在著手進行由新輔助質粒包裝的 rAAV載體的免疫反應研究，如果成功，將可能解決肝臟內具有復制能力 AAV病毒污染而引發(fā)的免疫反應。這種新方法同樣可以應用于其他類型病毒載體的構建，進一步解決基因治療中由復制能力病毒污染而引起的免疫問題。

2.2 消除轉基因特異性免疫反應

免疫問題仍是基因治療無法在臨床上取得突破性進展的關鍵所在[17]。到2009年12月，世界范圍內各國批準的基因治療臨床實驗項目已經達到1 579項 (http://www.abedia.com/wiley/)，卻由于存在免疫反應、轉染效率等問題，迄今只有一項基因治療產品面世。在基因治療的過程中，很多因素都能誘發(fā)免疫反應[2]。但以病毒載體本身以及轉基因產物在抗原遞呈細胞中表達所引起的特異性免疫最為重要[18]，它是當前基因藥物無法持久表達的主要障礙[19]。

為了解決這一難題，Brown等[20]率先將microRNA引入到克服轉基因特異性免疫反應領域，并取得了突破性的進展，作者認為，慢病毒介導的FIX不能持續(xù)維持高水平表達乃是慢病毒轉染脾臟來源的造血世系細胞并表達目的基因而誘發(fā)針對FIX的免疫反應所致。為此，研究人員將造血細胞特異性表達的miR-142-3p的4個miRTE克隆到目的基因的 3′UTR，以綠色熒光蛋白為報告基因的研究發(fā)現(xiàn)，在人類U937單核細胞和樹突狀細胞中，慢病毒介導的綠色熒光蛋白的表達量下降了近 100倍，而在 293細胞中表達量沒有顯著變化。隨后，他們又將這一成果用于 B型血友病治療。正如預期，含有4個miR-142-3p miRTE的慢病毒載體可使FIX持久穩(wěn)定的表達，且未發(fā)現(xiàn)抗-FIX的抗體，更沒有發(fā)生由FIX引起的免疫反應[21]。這充分說明由microRNA調節(jié)的靶向性病毒載體可以消除轉基因表達所引起的特異性免疫反應。此外，microRNA介導的質粒 DNA同樣具有消除免疫反應的效果。為了驗證這種消除特異性免疫反應的方法能否以及在多大程度上發(fā)揮作用，Wolff等[22]首次以質粒 DNA為載體，將4個miR-142-3p miRTE克隆到目的基因的3′UTR來驗證該方法的有效性。他們的可行之處在于既采用了 microRNA調控，又使用了組織特異性啟動子調控，并配合使用胞內蛋白和分泌蛋白進行了雙驗證。結果顯示由microRNA調節(jié)的靶向性載體可以消除轉基因表達所引起的特異性免疫反應，特別是配合使用組織特異性啟動子，可達到最佳效果。

2.3 增強溶瘤病毒的腫瘤靶向性基因治療

越來越多的研究表明宿主來源的 microRNA在病毒的復制和翻譯過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用，通過作用于病毒轉錄后元件，既可以抑制病毒感染[23-24]，也可以促進病毒的感染[25-26]，這為開發(fā) microRNA用于腫瘤靶向性基因治療提供了強有力的佐證。

2.3.1增強腫瘤靶向性

溶瘤病毒治療和自殺性基因治療已被證明是腫瘤靶向性基因治療的兩種行之有效的方法[27]。目前國內外正在開發(fā)的溶瘤病毒有腺病毒、單純皰疹病毒(HSV)、新城疫病毒、水皰性口炎病毒(VSV) 和脊髓灰質炎病毒等10多種。由于病毒具有復制能力以及在向瘤內注射過程中存在擴散等問題，毫無疑問提高溶瘤病毒的腫瘤靶向性是其在臨床上取得成功的關鍵。

研究表明 microRNA介導的調節(jié)可以提高溶瘤病毒的腫瘤靶向性。Edge等[13]通過將 let-7 miRTE置于野生型VSV基質蛋白的3′UTR，發(fā)現(xiàn)VSV在正常組織中不能復制，只能專一性地在腫瘤組織中生長。這是由于let-7在正常組織中表達量很高，但在腫瘤組織中表達明顯下降，載有l(wèi)et-7 miRTE的野生型VSV因受到let-7的調節(jié)而在正常組織中失去了復制能力。與 let-7相似，miR-143 和 miR-145在正常組織中表達量很高，但在乳腺癌組織中表達明顯下調。同樣基于microRNA表達量的變化，Lee等[14]將miR-143 和 miR-145用于調控HSV的腫瘤靶向性，并成功構建了專一性靶向乳腺癌組織的溶瘤病毒。

2.3.2降低毒副作用

作為一種新型溶瘤病毒，腺病毒的開發(fā)一直是國內外研究的熱點。研究表明腺病毒在向瘤內注射過程中極易擴散進入循環(huán)系統(tǒng)，感染肝組織，從而誘發(fā)肝毒性。因而肝毒性問題是腺病毒可否用于溶瘤病毒基因治療的瓶頸。為了攻克這一技術難關，幾乎兩個實驗室同時報道了利用 microRNA介導的調節(jié)作用來消除腺病毒所引發(fā)的肝毒性問題[11,28]。他們都采用了肝組織特異性 miR-122a作為調節(jié)分子，通過將其miRTE克隆到腺病毒關鍵基因E1A的3′UTR上，從而構建出了只能在其他組織復制而無法在肝組織復制的腺病毒。Cawood等[11]進一步證實這種經修飾的腺病毒絲毫沒有減弱其對腫瘤的殺傷能力，進而為腺病毒的成功開發(fā)提供了有利證據。與此同時，腺病毒介導的自殺性基因治療也因肝毒性的降低而變得更加安全、有效[12]。

此外，柯薩奇病毒 A21(CVA21) 所引發(fā)的肌肉毒副作用是困擾其成功用于溶瘤病毒治療的原因所在。體內試驗表明CVA21在大鼠體內能使腫瘤迅速退化，但同時會引起肌肉麻痹?；罱M織檢測發(fā)現(xiàn)CVA21僅存在于腫瘤組織和骨骼肌中，而不存在于其他組織，因此消除CVA21向骨骼肌組織的擴散是解決這一問題的關鍵。Kelly等[29]首次采用雙靶向的microRNA調控成功地解決了這一難題。他不但證明了將肌肉組織特異性miR-133和miR-206的miRTE置于CVA21的3′UTR能成功抑制其向肌肉組織的擴散，還驗證了兩個miR-133和兩個miR-206 miRTE的聯(lián)合應用要比4個miR-133或miR-206 miRTE的調控效果要好[29]。

VSV由于對免疫系統(tǒng)的敏感性特別是對Ⅰ型干擾素的敏感性而在正常組織中很容易被清除，但是這種易損性在大部分腫瘤組織中卻不起作用，正是基于這種原因以VSV為溶瘤病毒的基因治療已進入了Ⅰ期臨床實驗[30]。但是，VSV仍具有潛在的神經毒性，可引起致命性的大腦炎，因此消除VSV向中樞神經系統(tǒng)的滲透是其在臨床上取得廣泛應用的關鍵。

先前有很多研究致力于消除VSV的神經毒性，諸如修飾VSV的基因組使其對干擾素更敏感，雖然可以減弱病毒的毒性但同時也降低了病毒的抗腫瘤能力。為了避免削弱病毒的抗腫瘤能力，Stojdl等[31]采用microRNA介導的調控作用調節(jié)VSV在大鼠體內的分布以達到減弱病毒神經毒性的同時又不影響病毒抗腫瘤能力的目的。通過將大腦特異性 miRTE置于 VSV 基因組關鍵基因 (N gene，L gene) 的3′UTR從而構建重組型VSV(rVSV)，細胞學實驗顯示大腦特異性 microRNA對于 rVSV的生長動力學影響不大，體外實驗進一步證明外源性的大腦特異性microRNA mimics并不能顯著降低rVSV的細胞毒性，只有內源性表達的大腦特異性 microRNA才能顯著減弱rVSV的細胞毒性。為了驗證rVSV在大腦組織中毒性的減弱情況，作者將1×104rVSV注射到免疫缺陷鼠體內，對其觀察了35 d未發(fā)現(xiàn)任何并發(fā)癥發(fā)生。特別是將大腦特異性miR-125的miRTE置于L gene 3′UTR的rVSV (VSV 125r L)，在顱內注射1周后，10只大鼠中有9只大鼠正常，未發(fā)現(xiàn)神經毒性，且能健康生活到病毒注射后35 d；而在顱內分別注射VSV-Luc，VSV 125r M和VSV 206r L的大鼠則在 1周后發(fā)生了嚴重的神經毒性癥狀。作者又進一步驗證了 rVSV的溶瘤能力，通過將1×109rVSV注入到預先造好的腫瘤模型中，在第3天通過靜脈注射的方式將 1×109rVSV導入大鼠體內，通過對腫瘤大小的檢測和熒光圖像的采集，發(fā)現(xiàn)rVSV與VSV相比，無論是抗腫瘤能力還是病毒在瘤內的復制能力均沒有明顯區(qū)別[31]。

2.4 開發(fā)腫瘤免疫基因治療

腫瘤免疫治療是利用機體自身的免疫系統(tǒng)清除腫瘤的過程。開發(fā)腫瘤免疫治療的最大難題是需要激活大量的具有相同腫瘤專一性的T淋巴細胞以進行持久的治療。研究表明在造血干細胞中表達腫瘤特異性的T細胞抗原受體(TCR) 能夠持續(xù)激活腫瘤專一性的T淋巴細胞而達到免疫治療的目的[32]。載體介導的TCR既在胸腺細胞中表達又在成熟的T細胞中表達，因此就存在一個潛在問題：T細胞會對遺傳環(huán)境產生耐受，進而把自身的腫瘤抗原當作胸腺細胞克隆刪除的結果而無法激活[33]。因此只在 T細胞表達TCR，不在胸腺細胞中表達TCR將可以避免這一負選擇而進行持續(xù)的免疫治療。Papapetrou等[34]首次證明了miR-181a可以調控TCR在胸腺細胞和成熟T細胞中分開表達。miR-181a在胸腺細胞中表達量很高，但在T細胞中表達量急劇下降。通過將 miR-181a miRTE克隆到編碼抗原受體的慢病毒載體上，然后將其導入鼠BM細胞中，TCR的表達在胸腺細胞中被選擇性抑制，但在T細胞中恢復了表達，并且對腫瘤的攻擊有免疫保護作用[34]。這說明 microRNA調節(jié)病毒載體的靶向性可以實現(xiàn)目標基因在不同細胞中的選擇性表達，從而為腫瘤免疫基因治療的開發(fā)提供了有利的工具。

2.5 開發(fā)減毒活體疫苗

疫苗是抵抗病毒感染最有效的方法，在美國，每年因病毒感染而導致的死亡率下降了 99.9%[35]。在所有種類的疫苗中，活體疫苗因能激活免疫系統(tǒng)的全部元件，而成為世界各國競相開發(fā)的熱點。目前活體疫苗開發(fā)的主要障礙是缺乏一套有效的減毒方法，減毒后的疫苗仍具有恢復致病性的潛能。與此同時，病毒只有在特定組織復制才會引發(fā)疾病，如骨髓灰質炎病毒在腸胃中復制不會威脅生命，只有在腦干和運動神經元感染才會誘發(fā)骨髓灰質炎[36]。因此開發(fā)具有組織特異性的活體疫苗是活體疫苗消除其毒副作用的一條新途徑。

作為一個新領域，Barnes等[37]首次證明了microRNA同樣可以用于開發(fā)減毒活體疫苗。通過將內源性的let-7a和miR-124a的miRTE分別置于骨髓灰質炎病毒的5′UTR和兩個編碼元件之間，發(fā)現(xiàn)修飾后的病毒不能在中樞神經系統(tǒng)復制，并且大大降低了致病性。體內試驗顯示野生型髓灰質炎病毒的半致死劑量只有 2.2×106病毒顆粒 (Plaque-forming unit，PFU)，而經修飾的病毒其半致死劑量高達1×108PFU，當將1×108PFU的野生型病毒通過肌肉注射的方式注入小鼠體內，可迅速感染中樞神經系統(tǒng)，并在 6 d內引起麻痹和死亡；而將1×108PFU的修飾型病毒注入小鼠體內不會引起麻痹或死亡。實驗進一步驗證了將其開發(fā)成疫苗的可行性，通過向小鼠腹腔內注射修飾后的病毒，發(fā)現(xiàn)其免疫原性要優(yōu)于現(xiàn)在使用的疫苗，且對野生型病毒的再次攻擊具有免疫反應[37]。雖然這是 microRNA用于減毒活體疫苗開發(fā)僅有的一個例子，它卻為活體疫苗的開發(fā)提供了新的思路。

3 展望

基因治療在人類疾病治療中的地位越來越來重要，特別是在治療諸如癌癥[38]、糖尿病[39]、白血病、血友病[40]等現(xiàn)在用其他治療方法尚無法完全治愈的疾病方面所具有的前景被人們所普遍看好。但是由于載體本身[41]、轉基因產物的非特異性表達等[2]常常引起免疫反應，致使基因藥物無法進行持久治療。因此載體的靶向性、治療基因的可控性、免疫問題的祛除與克服仍是當前基因治療迫切需要解決的問題。

microRNA調節(jié)的靶向性病毒載體在基因治療領域的成功開發(fā)，為解決當前面臨的難題提供了新的思路和方法，但同時也應看到許多問題尚待回答。如microRNA的具體調節(jié)機制以及其在生命周期中的確切作用，能起到靶向性調節(jié)的microRNA的最低含量，能發(fā)揮最佳調控作用的 miRTE的數目以及相互之間的空間距離，miRTE在病毒載體上的插入位點等問題?，F(xiàn)在普遍認為將 miRTE插入功能基因或重要元件的 3′UTR上能發(fā)揮較好的調控效果[10,13,29]，但也有研究顯示將其插入 5′UTR上亦能發(fā)揮調控效果[37]?？傊?，這些問題的回答將對其在基因治療領域的成功開發(fā)具有重要的指導意義。此外，microRNA調控的靶向性病毒載體還存在一個潛在的問題，尤其是對溶瘤病毒來說，病毒極易在外源性的miRTE序列處產生突變，進而恢復病毒原有的組織滲透性和免疫原性。因此，如何避免 miRTE的突變將是當前研究的一個重點。其次，microRNA廣泛存在于人體內并發(fā)揮著重要的調節(jié)作用，但只有那些具有組織特異性或在病理條件下表達發(fā)生明顯變化的 microRNA才能在靶向性病毒載體的構建中所采用，所以，如何篩選這些具有獨特性質的microRNA也是迫切需要解決的問題。

本實驗室長期從事癌癥[38]、糖尿病[39]、血友病[40]等惡性疾病的基因治療研究，特別是近期利用microRNA調節(jié)病毒載體的靶向性的原理成功開發(fā)了一種新型的、細胞特異性的、內含多個組織特異如肝特異和造血特異序列拷貝的 microRNA結合序列的基因片段，通過控制包裝蛋白基因片段表達，進而達到在以肝臟為靶器官的血友病基因治療中徹底解決具有復制能力的AAV病毒污染問題[15]。如將這一基因片段同時應用于病毒包裝的輔助質粒和目的基因質粒，也許能同時解決因載體本身和轉基因產物分別誘發(fā)的免疫反應。

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Progress in application of targeting viral vector regulated by microRNA in gene therapy: a review

Guohai Zhang1, Qizhao Wang1, Jinghong Zhang1, and Ruian Xu1,2

1Institute of Molecular Medicine,Huaqiao University,Quanzhou362021,China
2Engineering Research Center of Molecular Medicine,Ministry of Education,Quanzhou362021,China

Received:January 5, 2010;Accepted:March 15, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2008AA02Z135), National Natural Science Foundation of China (No. 30900822).

Corresponding author:Ruian Xu. Tel/Fax: +86-595-22690952; E-mail: ruianxu@hqu.edu.cn

國家高技術研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2008AA02Z135)，國家自然科學基金 (No. 30900822) 資助。