王小嬌 席亞萍 張 明

華東師范大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 （上海 200062）

生物反硝化脫氮碳源上微生物的多樣性

王小嬌 席亞萍 張 明

華東師范大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 （上海 200062）

為了研究廢棄農(nóng)作物作為反硝化脫氮處理的新型碳源和生物膜載體中微生物的多樣性及微生物的群落結(jié)構(gòu)，將玉米芯作為反硝化碳源和生物膜的載體布置在河道中，采集同步脫氮過程中的玉米芯樣品并提取微生物總DNA，使用細(xì)菌通用引物對（GC341F和518R）從總DNA中成功擴增出目標(biāo)16SrDNA片段，然后對擴增的16SrDNA進(jìn)行變性梯度凝膠電泳（DGGE）測定，對凝膠染色并進(jìn)行條帶統(tǒng)計分析和切膠測序。結(jié)果表明以玉米芯為載體的生物膜優(yōu)勢菌變化規(guī)律與生存環(huán)境的變化存在較好的相關(guān)性，當(dāng)水體中溶解氧提高后，生物膜上的優(yōu)勢種群以好氧/兼氧的異養(yǎng)桿狀細(xì)菌Bacillus為主。

16SrDNA PCR DGGE

0 引言

由于城市化進(jìn)程的加快和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅猛發(fā)展，氮、磷等營養(yǎng)元素通過多種途徑匯入河流等水體，造成水體污染和富營養(yǎng)化問題日益突出。我國南方河流普遍存在低碳高氮現(xiàn)象，水體磷氮比過低使河流自凈過程中反硝化所需的碳源不足，導(dǎo)致硝態(tài)氮難以有效去除。

本測試基于生物硝化-反硝化原理，研究了在模擬河道中提高水體中的碳濃度，營造反硝化環(huán)境，這種好氧、兼氧的生物膜環(huán)境為脫氮提供了良好的環(huán)境。盡管很多研究者對脫氮的工藝條件進(jìn)行了大量研究，但是對其脫氮的微生物機理尚不清楚，現(xiàn)代分子生物學(xué)為深入研究環(huán)境中微生物提供了先進(jìn)的技術(shù)手段。

通過從模擬河道裝置中提取總DNA，并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和變性梯度凝膠（DGGE）和DNA測序等新的分子生物學(xué)技術(shù)，對生物膜中細(xì)菌多樣性和微生物群落進(jìn)行了研究，以獲得生物膜中細(xì)菌組成和動態(tài)變化規(guī)律。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集

待模擬河道裝置開始運行后，分別選取不同的時間點，采集載體玉米芯上的生物膜，具體采樣時間及裝置的運行狀態(tài)見表1。

表1 采樣點時間及運行狀態(tài)表

1.2 總DNA的提取

將從反應(yīng)器中采集的玉米芯樣品切割成2 cm大小，放入經(jīng)滅菌處理的含100 mL磷酸鹽緩沖溶液和玻璃珠（直徑3～4 mm）的三角燒瓶中，漩渦振蕩60 min，將玉米芯表面生物膜充分剝離，取含生物膜的液體部分10 000 r/min離心8 min，棄去上清液，沉淀部分即為含玉米芯表面生物膜的樣品。

離心沉淀的生物膜樣品采用進(jìn)口的FastDNA SPIN Kit for Soi（lQ-biogene,CA,USA)試劑盒進(jìn)行總DNA的抽提和純化。過程如下：取300 μL生物膜樣品加入122 μL的MT緩沖液，用珠磨器（Mini Beadbeater，USA）震蕩破碎樣品40 s；將離心管中的樣品在12 000 r/min下離心30 s；將上清液轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管中，加入250 μL PPS溶液，用手震蕩混勻10次；在12 000 r/min下將離心管中混勻的樣品離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到15 mL的干凈離心管中；在15 mL離心管中加入1 mL吸附懸浮液；顛倒混勻離心管2 min，靜置沉淀3 min；沉淀后移除500 μL上清液，將離心管中樣品重新混勻，吸出600 μL混和液到試劑盒提供的Spin濾管中，在12 000 r/min下離心1 min；將剩余的混和液加入Spin濾管中離心；在Spin濾管中加入500 μL SEWS-M溶液，在12 000 r/min下離心1 min；棄去離心液，繼續(xù)在12 000 r/min下離心2 min，以干燥剩余的SEWS-M溶液；將SpinTM濾管放入另一個干凈的離心管中，在室溫下放置干燥5 min；在SpinTM濾管中加入60 μL超純水，手指輕彈管壁，在12 000 r/min下離心1 min,離心液即為提取的DNA樣品。

采用紫外分光光度法對提取的總DNA進(jìn)行定量測定。目前認(rèn)為，在波長260 nm紫外線下，1OD（光密度數(shù)）的光密度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50 μg/mL。采用微量石英比色皿中將提取的DNA樣品稀釋后測定A260的數(shù)值，則DNA濃度C（ng/μL）＝A260×稀釋倍數(shù)/0.02。

1.3 PCR擴增

1.3.1 引物

根據(jù)文獻(xiàn)，選用真細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)通用擴增引物GC341F(5'CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGC GGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAG CAG 3')和518R(5'CGTATTACCGCGGCTGCTGG 3')，引物由上海生工公司合成。

1.3.2 擴增體系

PCR擴增體系為：Taq DNA聚合酶0.15 μL（5 U/μL），10倍反應(yīng)緩沖液為3 μL，其中Mg2+為1.8 μL（25 mmol），dNTP（10 mmol）為3 μL，引物為0.5 μL（10 μmol PL），最后加滅菌的ddH2O至體積為30 μL。PCR試劑購自上海生工公司。

1.3.3 擴增程序

PCR反應(yīng)在PCR儀（PTC-0200G、ALS-1244G、Bio-Rad，USA）上進(jìn)行，反應(yīng)過程為94℃變性5 min，然后94℃變性50 s，54℃退火50 s，72℃延伸2.5 min，循環(huán)29次，然后在72℃保持10 min。

1.3.4 PCR擴增檢測

用1%瓊脂糖凝膠電泳，核酸染料染色并拍照（Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)，BIO-RAD，USA）。電泳檢測時采用Marker DL2000（2 000、1 000、750、500、250、100 bp）作為分子量大小的標(biāo)記。

1.3.5 DGGE分析

采用Dcode Universal Mutation System DGGE電泳系統(tǒng)（Bio-rad，USA）進(jìn)行DGGE分析，10%聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度35%～55%（100%變性劑含7 mol·L-1尿素和40%去離子甲酰胺），上樣量為25 μL PCR產(chǎn)物，60℃、85 V恒定電壓下電泳8 h。電泳結(jié)束后，凝膠用SYBR Green核酸染液染色30 min，于GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）上成像檢測并拍照。

1.3.6 測序

對聚丙烯酰胺凝膠上的目的條帶在Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)上（BIO-RAD，USA）進(jìn)行切膠，回收的凝膠條帶搗碎于30 μL無菌ddH2O中，放置過夜，讓凝膠上的DNA溶解，而后進(jìn)行PCR擴增，采用由上海生工合成的細(xì)菌16SrDNA通用引341F（5'CCTACGGGAGGCAGCAG 3'）和518R（5'CGTATTACCGCGGCTGCTGG 3）'進(jìn)行PCR擴增。用于后續(xù)的DGGE.PCR擴增體系為：Taq DNA聚合酶0.15 μL（5 U/μL），10倍反應(yīng)緩沖液為3 μL，其中Mg2+為1.8 μL（25 mmol），dNTP（10 mmol）為3 μL，引物為0.5 μL（10 μmol PL），最后加滅菌的ddH2O至體積為30 μL。PCR反應(yīng)的程序同1.3.3。PCR產(chǎn)物送上海生工公司測序。

2 結(jié)果和分析

2.1 生物膜總DNA的提取

玉米芯生物膜樣品總DNA的提取是采用PCR-DGGE技術(shù)進(jìn)行分析的前提和關(guān)鍵步驟。DNA提取純度影響后續(xù)的PCR擴增和多態(tài)性分析，提取的不完整性則會造成微生物種群多樣性的流失。從7個玉米芯生物膜樣品中提取的DNA通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗（見圖1）。

圖1 玉米芯生物膜總DNA的提取

電泳結(jié)果顯示，本研究采用的提取方法可以順利提取出樣品中的總DNA。

2.2 PCR產(chǎn)物

電泳檢測結(jié)果見圖2。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳檢測圖

由圖2可知，用引物GC341F/518R對玉米芯生物膜總DNA樣品擴增后的DNA片段大小約為220 bp，與相應(yīng)16SrDNA上目的片斷長度177 bp和GC夾（40 bp）長度之和相當(dāng)，因此認(rèn)為用引物341FGC/518R對玉米芯生物膜DNA的PCR實驗結(jié)果可靠，可用于下一步DGGE分析。

2.3 PCR-DGGE-切膠測序

玉米芯生物膜總DNA的16SrDNA V3區(qū)片段DGGE指紋圖譜見圖3。

圖3 玉米芯生物膜擴增的16SrDNA進(jìn)行DGGE圖譜

將玉米芯生物膜總DNA的16SrDNA V3區(qū)片段DGGE圖譜中的主要優(yōu)勢條帶進(jìn)行DGGE切膠回收，采用PCR-DGGE凝膠電泳多次純化后切膠，PCR擴增后送上海生工公司測序。

2.4 優(yōu)勢菌群16SrDNA片段測序（比對結(jié)果見表2）

表2 部分優(yōu)勢菌16SrDNA DGGE片斷測序分析結(jié)果

表2 （續(xù)）

從表2可知，優(yōu)勢菌群主要包括Bacillus為好氧/兼氧的異養(yǎng)細(xì)菌，Clostridiaceae等均為兼氧/厭氧的異養(yǎng)細(xì)菌，體內(nèi)均含有硝酸還原酶。這與這些玉米芯所處的生境均相吻合。

硝酸還原酶（nitrate reductase）可分為參與硝酸鹽同化的同化型還原酶和催化以硝酸鹽為活體氧化的最終電子受休的硝酸鹽呼吸異化型（呼吸型）還原酶。同化型存在于高等植物、藻類、菌類及細(xì)菌，是由含Mo、黃素和正鐵血紅素的亞單位所成的酶，即分子內(nèi)具有小的電子遞體。菠菜、小球藻的酶其分子量約20萬，作為電子供體，藍(lán)藻為鐵氧還蛋白，菌類主要為NADPH，而綠色植物主要為NADH，可由硝酸鹽誘導(dǎo)，可被氨和有機氮的抑制。異化型酶存在于許多兼性好氧性細(xì)菌中，多為與膜結(jié)構(gòu)結(jié)合的不溶性的，一般含鐵及鉬分子量數(shù)十萬，似以細(xì)胞色素為電子供體，而專性嫌氣性細(xì)菌產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）的酶是可溶性的，以鐵氧還蛋白為電子供體。

3 結(jié)論

本測試所用的方法能成功地提取玉米芯載體上微生物DNA。以玉米芯為載體和碳源的生物膜上優(yōu)勢種的變化規(guī)律與裝置的運行狀況呈現(xiàn)較好的相關(guān)性：即當(dāng)水體溶解氧水平較低時，生物膜上的優(yōu)勢種以兼氧/厭氧的Clostridium等反硝化異養(yǎng)菌為主，當(dāng)水體中溶解氧水平提高后，生物膜上的優(yōu)勢種以好氧/兼氧的Bacillus等異養(yǎng)桿狀細(xì)菌為主。好氧/兼氧的異養(yǎng)反硝化細(xì)菌的出現(xiàn)更好地為高溶解氧水平下模擬河道裝置的反硝化脫氮提供了理論支持。

（略）

Q935

王小嬌 女 1982年生 華東師范大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院環(huán)境科學(xué)系在讀碩士 研究方向：環(huán)境微生物

2010年3月