劉曉庚，李鳳月，張少青，潘建鋒

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210003)

女貞果實的抗氧化性測定

劉曉庚，李鳳月，張少青，潘建鋒

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210003)

以南京產(chǎn)女貞果實為原料，考察不同提取劑對女貞果實不同部位(全果、果皮、核殼和果仁)提取所得提取液對DPPH自由基的清除效果，比較向陽面和向陰面不同生長期女貞果實的乙醇提取液對DPPH自由基的清除效果，研究固體狀乙醇提取物的抗氧化性，測定女貞果實抗氧化的主要化學(xué)成分和固體狀乙醇提取物的感官指標(biāo)。結(jié)果表明：極性溶劑提取液表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力；不同提取劑對女貞果實不同部位的提取物清除DPPH自由基能力的順序為：甲醇、水的提取物為果皮＞全果＞核殼＞果仁，丙酮、乙酸乙酯、乙醇的提取物為果皮＞全果＞果仁＞核殼；提取物在低濃度區(qū)對DPPH自由基的清除作用與濃度成正相關(guān)，且斜率大大高于高濃度區(qū)，而高濃度區(qū)對DPPH自由基的清除作用與濃度的關(guān)系較復(fù)雜，表現(xiàn)為與提取劑密切相關(guān)。另外果實以成熟初期的提取物對DPPH自由基清除率最高，在成熟中期和過成熟期后均有不同程度下降，而且向陽面生長果實提取物對DPPH自由基的清除率顯著高于向陰面果實提取物。抗氧化比較實驗得到所制備的固體狀女貞全果乙醇提取物抗氧化效果(IC50=5.38～10.46)與VC(IC50=8.59)相當(dāng)，低于茶多酚(IC50=1.70)。另外，水溶性好、呈深咖啡色固體狀的乙醇提取物有望成為一種新型高效抗氧化劑。

女貞果實；提取物；抗氧化性；抗氧化成分；DPPH自由基；清除率

Abstract：The DPPH radical scavenging effects of different solvent extracts from different parts ofLigustrum lucidumfruit growing in Nanjing were comparatively investigated. Moreover, the effects of sunlight illumination and growth period on the DPPH free radical scavenging activity of ethanol extract from wholeLigustrum lucidumfruit were examined, and the lyophilized ethanol extract from wholeLigustrum lucidumfruit was subjected to sensory evaluation and comparison with VC and tea ployphenols in free radical scavenging capacity. Polar and non-polar solvents were employed to extractLigustrum lucidumfruit,and the extracts derived from polar solvent extraction showed stronger DPPH free radical scavenging capacity. Solvents and fruit parts both made a difference to DPPH free radical scavenging capacity. The same solvent extracts from different fruit parts obtained with methanol, ethanol or water were ranked in the following order starting with the strongest:peel ＞ whole fruit ＞shell ＞ kernel. For acetone, ethyl acetate and ethanol extracts, the order was peel ＞ whole fruit ＞ kernel ＞ shell. All five solvent extracts from whole fruit showed a positive correlation between DPPH free radical scavenging activity and concentration in the lower concentration range, and the slopes were much higher than those in the higher concentration range. However, the concentration-effect relationship in the higher concentration range was complicated and closely associated with solvent type.The highest DPPH free radical scavenging activity ofLigustrum lucidumfruit was observed at the early ripening stage, followed by different decreases at the middle and post ripening stages. The ethanol extract fromLigustrum lucidumfruit exposed to sunlight revealed significantly higher DPPH free radical scavenging activity than that fromLigustrum lucidumfruit unexposed to sunlight.The lyophilized ethanol extract from wholeLigustrum lucidumfruit had a DPPH free radical scavenging capacity (IC50=5.38－10.46) equivalent to that (IC50=8.59) of VC but lower than that (IC50=1.70) of tea polyphenols. The solid water-soluble ethanol extract in dark brown is a potential effective antioxidant.

Key words：Ligustrum lucidumfriut；extract；antioxidant activity；antioxidant compound；DPPH radicals；scavenging rate中圖分類號：R282.71 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1002-6630(2010)21-0058-04

女貞果實(Ligustrum lucidumAit)作為藥食用已有2000多年歷史，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》就將其列為“延年”之品，而《本草綱目》記載：“女貞子……強(qiáng)陰，健腰膝，變白發(fā)，明目”。現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究表明女貞果實有降血糖、降血脂、抗菌消炎、降低眼壓、抗血卟啉衍生物(HPD)光氧化作用以及保肝護(hù)肝和抗動脈硬化、抗癌、抗突變等功效[1]。目前已發(fā)現(xiàn)女貞果實的化學(xué)成分有萜類、黃酮類、苯醇類、多糖、脂肪酸、氨基酸、揮發(fā)油及其他化合物100多種[2]，它們大多具有抗氧化功能。植物抗氧化劑廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健品和化妝品等行業(yè)，已建立了體外試管法、動物實驗法和人體實驗法等評價物質(zhì)抗氧化活性。本研究以常用的體外試管法中應(yīng)用最廣、方法簡便的2,2-二苯代苦味?；诫禄?2,2-Diphenyl-1-picryl hydrazyl，DPPH自由基)檢測法來測定和評價女貞全果、果皮、果仁等可食性部分的抗氧化活性，以期開發(fā)女貞果實用作食用抗氧化劑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

于2008年7月至2009年1月在無雨天或晴天，以采自南京市三叉河地區(qū)和南京財經(jīng)大學(xué)校園內(nèi)的成年女貞樹不同生長期和生長部位的新鮮果實為原料，經(jīng)脫粒、除雜、清洗、自然晾至表面無水珠后，手工將果實剝果分離出果皮、核殼和果仁，分別裝瓶于冰箱中保鮮貯藏備用。

DPPH自由基試劑(分析純) 日本和光純藥工業(yè)株式會社；茶多酚為自制精品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；水為二次蒸餾水或去離子水。

UV1102分光光度計 上海天美科學(xué)儀器有限公司；KH3000全波長薄層掃描儀 上?？普軆x器有限公司；高速萬能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；BS224S電子分析天平 北京賽多利斯公司；TDL-80-2B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；ALPHA1-4 LD微型冷凍干燥機(jī) 德國Marein公司。

1.2 方法

1.2.1 試液及固體提取物的制備

將女貞全果、果皮、核殼和果仁樣品分別用搗碎機(jī)搗碎后稱取約10g(準(zhǔn)確至0.1g)，分別包裹好后再分別以不同的提取劑(用量100mL)在水浴上用索氏提取器提取至回流液無色，分離，提取液用相同的提取劑定容至100mL即為提取原液。將其置于冰箱避光冷藏，使用前以3000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移出清液備用。將用此法提取的全果80%乙醇提取原液經(jīng)低溫(≤50℃)真空濃縮脫除溶劑后，再冷凍干燥制成固體狀女貞果實抗氧化物。

1.2.2 清除DPPH自由基能力的測定

準(zhǔn)確稱取DPPH試劑65.6mg (準(zhǔn)確至0.01mg)，用95%乙醇溶解定容至250.0mL，即得0.2624mg/mL(6.65×10-4mol/L) DPPH貯備液，置于冰箱中避光冷藏備用，使用前用95%乙醇稀釋。

將DPPH貯備液稀釋至52.48mg/L使用液。在試管中依次加入4.0mL DPPH使用液，用80%乙醇稀釋至10.0mL，混勻后置于25℃水浴中恒溫5min，立即用1cm比色皿在517.5nm處(DPPH濃度與吸光度關(guān)系為A=0.0273cDPPH－0.0084，r2=0.9936)測吸光度(A0)；加入1.00mL待測樣液，用95%乙醇稀釋至10.0mL，混勻后置于25℃水浴中恒溫5min，立即用1cm比色皿在517.5nm波長處測吸光度(Ar)；加入4.0mL DPPH使用液和1.00mL待測液，用95%乙醇稀釋至10.0mL，混勻后置于25℃水浴中恒溫5min，立即用1cm比色皿在517.5nm處測吸光度(As)。按式(1)計算自由基清除率(Y)[3]。

也可以采用清除單位質(zhì)量DPPH自由基達(dá)到50%清除率時所加入抗氧化劑的質(zhì)量來表示抗氧化劑清除DPPH自由基能力，即IC50值。IC50值越低，抗氧化劑的自由基清除能力越強(qiáng)[4]。按式(2)計算IC50值。

式中：mDPPH自由基為加入的DPPH質(zhì)量/mg；m50為自由基清除率為50%時加入的試樣溶液中溶質(zhì)質(zhì)量/mg(取5.00mL不同提取原液，用減壓蒸發(fā)法烘干稱質(zhì)量)。

1.2.3 提取物成分的測定

參照文獻(xiàn)[5]的薄層掃描法測定試樣中齊墩果酸和熊果酸的含量；參照文獻(xiàn)[6]的AlCl3顯色光度法測定試樣中總黃酮含量；參照文獻(xiàn)[7]的苯酚-濃硫酸顯色光度法測定試樣中多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 女貞果實提取液抗氧化的主要化學(xué)成分分析

在查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[1-3,5-10]，經(jīng)薄層層析法定性比較分析和按1.2.3節(jié)測定方法進(jìn)行定量測定，結(jié)果得女貞果實的抗氧化成分主要是花青素、單寧等酚類和齊墩果酸、熊果酸等三萜類，芹菜素等黃酮類，紅景天皂苷等苷類和還原性多糖類等化合物。這些都屬于水溶性化合物，因此女貞果實中抗氧化成分宜用極性的水溶性溶劑進(jìn)行提取，這與本實驗用極性不同提取劑得到的女貞果實提取物的抗氧化性強(qiáng)弱的實驗結(jié)果(表1)相一致。

2.2 女貞果實提取液抗氧化性能的影響因素

2.2.1 不同提取劑提取物的抗氧化性

選用極性不同的提取劑對女貞果實樣品提取得到的這些提取劑的提取效果存在明顯差異。乙醇和甲醇提取物的組成基本一致，且含量較高；而水、丙酮和乙酸乙酯各自的提取物組成不一樣，而且與乙醇和甲醇提取物的組成不同，含量與乙醇和甲醇提取物相比較低，提取效果最差的是非極性的環(huán)已烷。這是由于被提取物女貞果實樣品的化合物組成和性質(zhì)等不同的原因而形成的。另外，不同提取劑所得提取液的顏色有差別(表1)，這也表明各提取液的成分存在差異。由于果皮中含有的色素最高，且果皮占新鮮全果比例大，核殼主要含有多酚類色素，果仁主要是淀粉和脂肪酸等，所以，得到的提取液是果皮的顏色最深，全果的次之，果仁的顏色最淺。由于在果皮、全果、核殼和果仁中的色素成分不同，因此，在對不同提取劑所得到的提取液的顏色不一樣。

圖1 不同提取劑提取液的紫外-可見光譜Fig.1 UV scanning spectra of different solvent extracts from wholeLigustrum lucidumfruit

表1 不同提取物對DPPH自由基清除效果(2008-09-15采樣)Table 1 Color and DPPH free radical scavenging capacity of different solvent extracts from different parts ofLigustrum lucidumfruit

由于女貞果實的抗氧化物主要是齊墩果酸、熊果酸、花青素、單寧、芹菜素和還原性多糖類等一些極性的化合物，因此，在提取上表現(xiàn)出極性溶劑提取液有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的抗氧化性，而非極性環(huán)已烷的提取物無清除DPPH自由基的能力，其順序為：果皮和全果的提取液是乙醇＞甲醇＞丙酮＞水＞乙酸乙酯＞環(huán)已烷，而果仁是乙醇＞甲醇>乙酸乙酯＞丙酮＞水≈環(huán)已烷，核殼是乙醇≈甲醇＞水＞丙酮＞乙酸乙酯>環(huán)已烷(表1)。另外，從表1還可看出，供試樣品提取液清除DPPH自由基能力的順序為：甲醇和水的提取液是果皮＞全果＞核殼＞果仁，丙酮、乙酸乙酯、乙醇的提取液是果皮＞全果＞果仁＞核殼。這是由于極性低的丙酮、乙酸乙酯有利于果仁中抗氧化性的脂肪酸的溶出，而強(qiáng)極性甲醇和水對脂肪酸的溶出能力較弱。

圖2 不同質(zhì)量濃度的不同提取液對DPPH自由基的清除率Fig.2 DPPH free radical scavenging rates of different solvent extracts from wholeLigustrum lucidumfruit at different concentrations

如圖2所示，通過考察不同質(zhì)量濃度的幾種提取劑得到的提取物對DPPH自由基的清除率實驗結(jié)果表明，乙醇、甲醇、丙酮、水和乙酸乙酯這5種溶劑的提取物在低質(zhì)量濃度下均表現(xiàn)出對DPPH自由基有較強(qiáng)的清除作用，但其清除率與質(zhì)量濃度的關(guān)系并不是簡單的線性正比例，而是較為復(fù)雜關(guān)系，其中甲醇和乙醇提取物的質(zhì)量濃度與清除率始終表現(xiàn)為正相關(guān)性，只是低質(zhì)量濃度區(qū)的斜率大大高于高質(zhì)量濃度區(qū)；而水提取物在低質(zhì)量濃度區(qū)域內(nèi)與清除率表現(xiàn)為正相關(guān)性，其后清除率相對穩(wěn)定；丙酮和乙酸乙酯的提取物則是在低質(zhì)量濃度區(qū)域內(nèi)與清除率表現(xiàn)為正相關(guān)性，其后為負(fù)相關(guān)性，但并不顯著。這一結(jié)果表明女貞果實提取物是高效的植物抗氧化劑。

2.2.2 女貞果實不同生長期和生長部位的抗氧化性

考察了女貞果實不同生長期和生長部位全果的乙醇提取液對DPPH自由基的清除率。經(jīng)測定果實在未成熟期和成熟初期起抗氧化作用的主要成分花青素、單寧等酚類和齊墩果酸、熊果酸等三萜類等化合物，在成熟中期起抗氧化作用的主要成分齊墩果酸、熊果酸等三萜類，芹菜素等黃酮類和花青素、單寧等酚類等化合物，而在成熟后期和過熟期起抗氧化作用的主要成分齊墩果酸、熊果酸等三萜類和還原性多糖類等化合物，這些化合物的含量隨生長期而改變。因此，表現(xiàn)出提取液對DPPH自由基的清除率在未成熟期隨生長期延長而增加，到成熟初期達(dá)到高峰值，隨后在成熟中則前期下降后期緩慢上升，到成熟后期達(dá)到略低于成熟初期的又一高峰值，隨后明顯下降。另外，生長在向陽面的果實提取液對DPPH自由基的清除率(33.96%～59.20%)明顯高于向陰面的果實(20.03%～38.49%)，且兩者在生長期的抗氧化的變化規(guī)律相一致。這為制得高品質(zhì)女貞果實抗氧化物的原料質(zhì)量控制提供了一定依據(jù)。

表2 女貞果實提取物的感官質(zhì)量和抗氧化性比較實驗結(jié)果(2008-09-15采樣)Table 2 Sensory evaluation of lyophilized ethanol extract from wholeLigustrum lucidumfruit and comparison of IC50for scavenging DPPH radicals with VC and tea polyphenols

圖3 不同采樣日期不同部位女貞果乙醇提取液對DPPH自由基的清除率Fig. 3 DPPH free radical scavenging rates of ethanol extracts from wholeLigustrum lucidumfruit at different growth stages

2.3 女貞果實抗氧化提取物的感官分析及抗氧化性比較

由表2可見，實驗制備的固體狀女貞全果乙醇提取物為有色的粉末狀水溶性物質(zhì)，無異味，其抗氧化性與VC相當(dāng)，但低于茶多酚。而且由于女貞果實是易得的原料，制備成抗氧化劑成本低，因此具有良好的發(fā)展前景。

3 結(jié) 論

女貞果實中含有豐富的水溶性且具抗氧化性的化合物，經(jīng)測定其主要抗氧化成分是花青素、單寧等酚類，齊墩果酸、熊果酸等三萜類，芹菜素等黃酮類，紅景天皂苷等苷類和還原性多糖類等化合物。其成分隨果實生長期不同成分的組成和相對含量均有明顯變化，因此，女貞果實提取物的抗氧化性也不一樣，以果實成熟初期的抗氧化最高，在成熟中期和過成熟期后的抗氧化性均有不同程度下降。不同提取劑對女貞果實抗氧化成分的提取效果存在顯著差異，對果皮和全果的順序是：乙醇＞甲醇＞丙酮＞水＞乙酸乙酯＞環(huán)已烷；對果仁則是：乙醇＞甲醇＞乙酸乙酯＞丙酮＞水≈環(huán)已烷；而核殼是：乙醇≈甲醇＞水＞丙酮＞乙酸乙酯＞環(huán)已烷。生長于向陽面的女貞果實的抗氧化性顯著高于生長于向陰面的果實。女貞果實提取物的抗氧化效率上表現(xiàn)出低質(zhì)量濃度范圍顯著高于高質(zhì)量濃度范圍。通過抗氧化性的比較實驗得到女貞果實乙醇提取物的抗氧化性(IC50=5.38～10.46)與VC(IC50=8.59)相當(dāng)，低于茶多酚(IC50=1.70)。因此，女貞果實乙醇提取物是種高效的抗氧化劑。

固體狀女貞果實乙醇提取物為深咖啡色，且有女貞果實特有的氣滋味，水溶性好，能滿足在糕點、面制品和飲料等多種食品應(yīng)用的要求，但其應(yīng)用實驗和女貞果實乙醇提取物安全性實驗等均有待進(jìn)一步研究。然而女貞果實是一種在我國城鄉(xiāng)分布很廣泛、產(chǎn)量十分巨大的低廉植物資源，目前只在藥用上有一定的開發(fā)利用，在食品上的開發(fā)利用卻極少，因此，在食品上大力深入開發(fā)利用女貞果實具有重要價值。

[1] 李曼玲, 劉美蘭, 馮偉紅. 中藥女貞子研究進(jìn)展[J]. 中國中藥雜志,1994, 19(8):504-506.

[2] 金華. 中藥女貞子化學(xué)成分的研究現(xiàn)狀[J].吉林化工學(xué)院學(xué)報, 2008,25(2):35-37; 41.

[3] 陳叢瑾, 黃克瀛, 李德良, 等. 香椿葉提取物清除DPPH自由基能力的測定方法[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2006, 26(3):69-72.

[4] DUNG N T, KIM J M, KANG S C. Chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil and the ethanol extract ofCleistocalyx operculatus(Roxb.)Merr and Perry buds[J]. Food and Chemical Toxicology, 2008, 46:3632-3639.

[5] 曹艷麗, 張秋香. 薄層掃描法測定女貞子中齊墩果酸和熊果酸的含量[J]. 陜西中醫(yī), 2002, 23(8):745-746.

[6] 徐小花, 楊念云, 錢士輝, 等. 女貞子黃酮類化合物的研究[J].中藥材, 2007, 30(5):538-540.

[7] 張興輝, 石力夫. 不同產(chǎn)地女貞子中多糖的含量測定[J]. 藥學(xué)服務(wù)與研究, 2004, 4(1):14-16.

[8] 劉曉庚, 孫明, 溫世和, 等. 女貞子果皮紅色素的提取及穩(wěn)定性研究[J].食品與機(jī)械, 2003(1):26-29.

[9] 王環(huán)宇. 女貞子萃取物對肉仔雞抗氧化機(jī)能及肉質(zhì)風(fēng)味的影響[D].沈陽:東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

[10] 林文群, 陳忠, 李萍, 等. 女貞果實及種子的化學(xué)成分[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報, 2002, 11(1):55-56.

Determination of Antioxidant Activity of Extracts fromLigustrum lucidumFruit

LIU Xiao-geng，LI Feng-yue，ZHANG Shao-qing，PAN Jian-feng
(College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China)

2010-05-03

劉曉庚(1962—)，男，教授，碩士，主要從事應(yīng)用化學(xué)與食品化學(xué)研究。E-mail：lxg_6288@163.com