武五愛,郭滿棟,高寶平

(山西師范大學化學系,山西臨汾041004)

溶膠-凝膠血紅蛋白電化學傳感器的研制

武五愛,郭滿棟＊,高寶平

(山西師范大學化學系,山西臨汾041004)

運用溶膠-凝膠技術將血紅蛋白(Hb)固載于玻碳電極(GC)表面,制得 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極,找出了制備 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極的最佳實驗條件,建立了一種測定過氧化氫的新的、靈敏的方法.同時對該電極與過氧化氫的作用機理進行了探討.

血紅蛋白;溶膠-凝膠;生物傳感器;修飾電極

血紅蛋白(Hemoglobin,Hb)是體血液中紅細胞的主要成分,盡管其不具備傳遞電子的功能,但由于它具有別構效應且對其結構已有較清楚的認識以及價廉易得,常常被選作探討生物大分子電化學行為的理想模型物,國內(nèi)外研究者對 Hb的結構與功能、電化學行為、小分子及金屬離子與 Hb的相互作用等方面進行了大量的研究[1-4].近年來,人們發(fā)現(xiàn)溶膠-凝膠材料是一類非常適合于固定生物試劑的基質(zhì)材料[5-9].凝膠過程通常在溫和的條件下進行,可以很大程度地保持酶等生物物質(zhì)的功能和活性[10-11].利用溶膠-凝膠技術固定各種生物試劑基質(zhì)材料,制成的生物傳感器具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、抗干擾能力強等特點[12-15].作者采用硅溶膠-凝膠技術制備了溶膠-凝膠固載血紅蛋白的直接電化學傳感器,找出了制備的最佳條件,并用多種方法對其電化學行為進行了研究.結果表明 Hb在膜中能夠保持良好的生物活性和催化性質(zhì),且電極具有穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好,制備方法簡便易行的優(yōu)點.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

正硅酸乙酯(TEOS,中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司);十六烷基三甲基溴化銨(上?；瘜W試劑采購供應站分裝廠),牛血紅蛋白(Hemoglobin,國藥集團上?；瘜W試劑有限公司);其他試劑均為分析純.實驗用水為二次蒸餾水.

L K98BⅡ微機電化學分析系統(tǒng)(天津蘭力科化電子高技術有限公司);KQ-50超聲洗滌器(上海超聲儀器廠);UV-2201(日本島津);p HS-3C型酸度計(上海偉業(yè)儀器廠).玻碳電極:直徑d=2 mm(工作電極);鉑絲電極(輔助電極);Ag/AgCl(飽和 KCl)電極(參比電極).

1.2 實驗過程

1.2.1 玻碳電極的處理

將玻碳電極用氧化鋁粉拋光,在二次水和無水乙醇中分別超聲洗滌5 min,并重復3次,然后進行電化學活化處理,即在0.5 mol/L的 H2SO4中于-0.3 V～1.5 V進行循環(huán)伏安(CV)掃描,直到獲得穩(wěn)定的循環(huán)伏安響應.

1.2.2 儲備液的配制

血紅蛋白(Hemoglobin,Hb)儲備液:稱取50 mg牛血紅蛋白,用水稀釋,并定容至10 mL的容量瓶中,避光4℃保存,使用時逐級稀釋.

溶膠-凝膠儲備液:在室溫下將1 mL正硅酸乙酯,0.2 mL 0.1 mol/L的HCl和3 mL水、10 mL乙醇混合于20 mL密封瓶中,超聲震蕩30 min,至形成均一溶膠液,密封存放于陰暗處.

表面活性劑儲備液:稱取0.25 g十六烷基三甲基溴化銨,加10 mL乙醇溶解,用水定容至25 mL,密封保存.

1.2.3 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極的制備

取配制好的溶膠-凝膠儲備液和表面活性劑儲備液各1 mL,攪拌均勻后加入0.5 mL血紅蛋白(Hemoglobin,Hb)儲備液,置于一密閉容器中超聲震蕩5 min,使其分散均勻.吸取8μL該溶液,均勻涂敷在玻碳電極表面,置于4℃冰箱中干燥10 h以上,即可制得 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極.該電極不用時可將其置于鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液(p H=6)中并放入4℃冰箱中保存.相同條件下制備Sol-Gel/GC電極作為比較電極.

1.2.4 實驗方法

電化學實驗采用三電極體系:Ag/AgCl(飽和 KCl)電極為參比電極、鉑絲為輔助電極、Hb/Sol-Gel/GC修飾電極為工作電極;緩沖液為鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液(p H=6).實驗時先向溶液中通氮氣10 min,并保持緩沖液在實驗過程中的氮氣氣氛.

2 結果與討論

2.1 修飾電極的電化學行為

2.1.1 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極的循環(huán)伏安行為

將干燥后的 Hb/Sol-Gel/GC電極從冰箱中取出,在空氣中放置不同時間后放入鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液(p H=6)中進行循環(huán)伏安掃描(掃描范圍 -1.5 V～0.4 V,掃速為100 mV/s),如圖1所示.圖中曲線1為從冰箱中取出立即掃描所得曲線,可以看出在-0.450 V附近有一不可逆還原峰;隨著電極在空氣中放置時間的增加,發(fā)現(xiàn)在-0.450 V處還原峰逐漸消失,而在-0.891 V處有一新的不可逆還原峰出現(xiàn),且隨放置時間延長峰電流逐漸增大,在60 min后逐漸趨于穩(wěn)定(曲線4);在溶液中加入1×10-5mol/L過氧化氫后-0.891 V處還原電流又顯著上升(曲線5).而在相同條件下的Sol-Gel/GC修飾電極和裸電極上沒有明顯還原峰出現(xiàn)(曲線2,曲線3).

2.1.2 Hb和Sol-Gel的紫外-可見吸收光譜

用紫外-可見吸收光譜考察了 Hb在溶膠-凝膠溶液中的吸收曲線,結果如圖2所示.其中圖2a為溶膠-凝膠溶液的Soret吸收帶曲線,圖2b為 Hb的Soret吸收帶曲線,圖2c為 Hb在溶膠-凝膠溶液中的Soret吸收帶曲線,通過比較可以看出血紅蛋白在溶膠-凝膠中能夠保持良好的生物活性和催化性質(zhì),沒有發(fā)生變性.

圖1 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極的循環(huán)伏安行為Fig.1 Cyclic voltammograms of Hb/Sol-Gel/GC modified electrode after different placed time

圖2 Sol-Gel和 Hb的紫外-可見吸收光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectra of Sol-Gel and Hb

2.2 實驗條件優(yōu)化

2.2.1 H2O與 TEOS的體積比對成膜性質(zhì)的影響

H2O與 TEOS體積比是一個重要參數(shù),直接與水解縮聚物的結構和溶膠的黏度和凝膠的時間有密切關系.較低的比值使Sol-Gel膜表面形成一些小的團聚,很難形成均一的薄膜,而且這樣形成的Sol-Gel膜非常容易開裂.過高的比值使Sol-Gel膜表面的團聚過大,以至于血紅蛋白很容易從表面上流失.為防止干燥過程較長產(chǎn)生較大的收縮張力,本實驗制備Sol-Gel溶液時 H2O與 TEOS的最佳體積比為3∶1.

2.2.2 表面活性劑濃度對成膜性質(zhì)的影響

在構建Sol-Gel膜的過程中,表面活性劑是一個非常重要的因素.因為凝膠中包裹著大量的溶劑和水,當它們從小孔中蒸發(fā)時,由于液體的表面張力造成的應力差易導致凝膠的開裂.表面活性劑由于揮發(fā)性低,吸附于電極表面能把不同孔徑中醇的不均勻蒸發(fā)大大降低,有效地減少內(nèi)部應力和表面張力,從而避免膜的開裂,并能夠改善溶膠-凝膠表面的團聚現(xiàn)象.

本實驗中采用不同濃度的十六烷基三甲基溴化銨為表面活性劑進行各種對比實驗.結果表明當十六烷基三甲基溴化銨濃度為1 g/L,并與所配Sol-Gel溶液及 Hb溶液(或水)以體積比1∶1∶0.5混合時所制膜最穩(wěn)定,不易開裂,且 Hb峰電流響應最好.

2.2.3 Hb在電極上的固載量對峰電流的影響

在其他條件固定的情況下,通過計算研究了玻碳電極(d=2 mm)上 Hb固載量對峰電流的影響,結果如圖3所示,由圖3可看出,隨著 Hb固載量的增加,還原峰電流逐漸增大.但當固載量超過1.6μg時峰電流呈現(xiàn)下降趨勢,這是由于當Hb固定量過大時,使包埋Hb的環(huán)境發(fā)生改變,電極表面的分布趨于復雜,膜的厚度也隨之增加,降低了電子的傳遞能力,從而造成了電極響應電流有下降的趨勢.因此本實驗選1.6μg為Hb在電極上的最佳固載量.

2.2.4 測定介質(zhì)對峰電流的影響

研究了Hb/Sol-Gel/GC電極分別在不同緩沖溶液如磷酸鹽緩沖溶液、Tris緩沖溶液以及鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液(p H調(diào)至約6、掃速100 mV/s)中的電化學行為,結果發(fā)現(xiàn) Hb/Sol-Gel/GC電極在三種緩沖溶液中均表現(xiàn)為不可逆還原,且在鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液中電流響應最大,峰電流最高.故選擇鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液為支持電解質(zhì).

2.2.5 掃描速率對峰電位的影響

研究了掃描速率對-0.891 V處峰電位的影響,結果發(fā)現(xiàn),還原峰電位 E(V)隨掃描速率v(V/s)的增大而負移.在0.005 V/s～0.7 V/s范圍內(nèi),E與lgv的線性方程為 E =0.062 2 lgv+1.126 7(R2=0.992 8),從曲線的斜率[0.5×2.303R T×(anF)-1],可得αn=0.475,取α=0.5,可計算得 n≈1;由此可見該峰為1電子不可逆的還原峰.

2.2.6 p H對峰電位、峰電流的影響

在優(yōu)化的實驗條件下,用循環(huán)伏安法研究了不同酸度對-0.891 V處還原峰電流的影響,結果見圖4.由圖4可以看出,當p H ≤6時,傳感器的響應電流隨著p H值的增加而增大,而當p H過大時峰電流又逐漸減小,這主要是因為血紅蛋白的活性依賴于p H范圍(正常人體生理范圍為6～8.5),過低或過高的p H降低了血紅蛋白的活性.因此,選p H=6作為本實驗的最適p H.

實驗同時考察了p H在4～8范圍內(nèi)酸度對-0.891 V處峰電位的影響,結果發(fā)現(xiàn),隨著p H的增大,還原峰電位正移,表明電極反應中有質(zhì)子參與.并根據(jù)公式dEp/dp H=0.059X/n(式中 X為質(zhì)子數(shù),n為電子數(shù)),求得 X≈1.

圖3 Hb固載量與峰電流的關系Fig.3 Relation between Hb quantity and peak current

圖4 p H對峰電流的影響Fig.4 Effects of p H on peak current

2.3 電極機理反應探討

結合以上實驗現(xiàn)象,本文對血紅蛋白在 Hb/Sol-Gel/GC電極上的電化學行為進行了詳細探討,得出以下結論:

Hb/Sol-Gel/GC電極先后在-0.450 V和-0.891 V處產(chǎn)生的還原峰是由包埋在修飾物中的 Hb產(chǎn)生,且由于電極表面有機介質(zhì)和表面活性劑的影響,電子轉(zhuǎn)移的可逆性受到抑制,為不可逆過程;而-0.450 V處還原峰的消失和-0.891 V處還原峰的出現(xiàn)則是由于Hb具有別構效應,高親氧態(tài)(R態(tài),0.450 V處)與低親氧態(tài)(T態(tài),0.891 V)間的構象轉(zhuǎn)變[16-17]:

在-0.891 V處產(chǎn)生還原峰電流,是由于Hb Fe heme(T)中一個血紅素輔基在電化學驅(qū)動下被溶液中殘氧氧化,發(fā)生一個電子轉(zhuǎn)移:

在加入過氧化氫后-0.891 V處還原電流顯著上升,則是Hb Fe(T)中一個血紅素輔基在電化學驅(qū)動下被 H2O2氧化所導致:

實驗表明,將使用過的Hb/Sol-Gel/GC電極懸置在緩沖溶液中一段時間(約30 min)可發(fā)現(xiàn)其又恢復至初態(tài),體現(xiàn)了較好的重復性.其反應機理可能是:

2.4 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極的穩(wěn)定性

穩(wěn)定性是衡量電極實用性的重要指標.因此,我們考察了 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極與其還原電流在緩沖溶液中保存時間的關系.結果發(fā)現(xiàn),將 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極密封懸置在鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液(p H=6)中,在4℃冰箱中保存23天,其峰電流僅下降12%,表明電極是比較穩(wěn)定的.

2.5 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極對 H2O2的響應

在優(yōu)化的實驗條件下,用方波伏安法(電位范圍:-0.4～ -1.2 V,電位增量50 mV,方波頻率5Hz,方波幅度50 mV)考察了修飾電極對 H2O2的響應,發(fā)現(xiàn)還原峰電流與 H2O2濃度分別在4.0×10-6～4.3×10-5mol/L(R2=0.993 6)及4.3×10-5mol/L～6.5×10-5mol/L(R2=0.986 1)范圍內(nèi)成線性關系,檢測限為2×10-6mol/L(S/N=3).

3 結論

利用溶膠-凝膠技術將血紅蛋白固載于玻碳電極表面,并用循環(huán)伏安法、方波伏安法和紫外-可見吸收光譜研究了血紅蛋白在修飾電極上的電化學行為.實驗發(fā)現(xiàn)血紅蛋白包埋在溶膠-凝膠中,能在玻碳電極上實現(xiàn)蛋白質(zhì)的直接電子轉(zhuǎn)移,表明溶膠-凝膠與血紅蛋白有較好的生物兼容性.實驗同時找出了 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極的最佳制備條件,表明該傳感器具有制作方法簡單,有較好重現(xiàn)性、穩(wěn)定性以及高靈敏度等優(yōu)點,在生化和臨床過氧化氫檢測中可望得到較為廣泛的應用.

[1]Gu H Y,Yu A M,Chen H Y.Direct electron transferand characterization of hemoglobin immobilized on an aucolloid-cysteamine-modified gold electrode[J].Electroanal Chem,2001,516:119-126.

[2]Ellerby L M,Nishida C R,Nishida F,et al.Encap sulation of protein in transparent porous silicate geasses prepared by the sol-gel method[J].Science,1992,255:1113-1115.

[3]劉傳銀,李學強,陸光漢.碳糊電極在有機物電化學分析中的應用[J].化學研究與應用,2005,17(4):443-447.

[4]王全林,楊寶軍,呂功煊,碳糊電極上無機膜固載血紅蛋白的直接電化學[J].高等學?；瘜W學報,2003,24(9):1561-1566.

[5]Wang Q L,Lu G X,Yang B J.Direct electrochemistry and electrocatalysis of hemoglobin immobilized on carbon paste electrode by silica sol-gel film[J].Biosens Bioelectr,2004,19:1269-1275.

[6]Wang Q L,Lu G X,Yang B J.Hydrogen peroxide biosensor based on direct electrochemistry of hemoglobin immobilized on carbon paste electrode by a silica sol-gel film[J].Chemical,2004,99:50-57.

[7]Liu H,Wang L,Hu N.Electrocatalysis by a C60cyclodextrin(1∶2)and nafion chemically modified electrode of hemoglobin[J].Electrochim Acta,2002,47:2515-2523.

[8]Jiang Z,Zuo Y.Incorporation of horseradish peroxidase in akieselguhr membrane[J].A nal Chem,2001,73(2):686-692.

[9]Bach U,Deng L P,Paul C,et al.Optimization of 1,2-dimethyl-3-propylimidazolium iodide concentration in dyesensitized solar cells[J].N ature,1998,395(5):583-588.

[10]Hulteen J C,Treichel D A,Smith M.Size and shape controlled fabrication of large-area periodic nanopillararrays[J].Phys Chem B.1999,103(4):3854-3859.

[11]Wen J Y,Wilkes GL.Synthesis of polystyrene-silica hybrid mesoporous materialsviathe nonsurfactant templated sol-gel process[J].Chem Mater,1996,8(3):1667-1673.

[12]宋昭,黃加棟,史海濱,等.納米碳管修飾鉑結合溶膠-凝膠固定酶制備高性能膽堿生物傳感器[J].分析化學,2006,34(7):910-914.

[13]李建平,彭圖治.溶膠-凝膠法固定膽固醇氧化酶偶聯(lián)普魯士藍化學修飾電極的研究[J].高等學?；瘜W學報,2003,24(5):798-820.

[14]黃加棟,史海濱,陳強,等.基于溶膠-凝膠技術結合多壁納米碳管化學修飾電極的方法制備高靈敏葡萄糖生物傳感器的研究[J].高技術通訊, 2006,16(5):492-496.

[15]李亞卓,張素霞,孫長青,等.基于溶膠-凝膠技術的聚烯丙胺基二茂鐵化學修飾電極的組裝及其對抗壞血酸的電催化氧化[J].高等學?；瘜W學報,2003,24(8):1373-1376.

[16]關凌霄,王全林.血紅蛋白在有機溶劑中的電化學行為及其類酶電催化研究[J].化學研究與應用,2006,18(9):1035-1040.

[17]高筱玲,郭彥,田燕妮,等.表面活性劑與血紅蛋白的作用對轉(zhuǎn)移電子數(shù)的影響[J].物理化學學報,2007,23(8):1178-1182.

Preparation of Modified Glassy Carbon Electrode with Hemoglobin Immobilized via Sol-Gel Route

WU Wu-ai,GUO Man-dong,GAO Bao-ping
(Department of Chemistry,Shanxi Normal University,Linf en041004,Shanxi,China)

Hemoglobin(Hb)was modified on the surface of glassy carbon(GC)electrode by sol-gel technology to generate a steady Hb/Sol-Gel/GC electrode.The optimal condition for preparing Hb/Sol-Gel/GC electrode was investigated,and a new sensitive analysis method for determination of H2O2is established based on the modified GC electrode.At the same time,the response mechanism between Hb/Sol-Gel/GC and H2O2is discussed.

hemoglobin;sol-gel;biosensor;modified electrode

O 657.1

A

1008-1011(2010)05-0063-05

2010-06-08.

山西省自然科學基金資助項目(20001057).

武五愛(1977-),男,副教授,主要從事電分析化學研究.＊

.E-mail:guomd@dns.sxnu.edu.cn.