王白羽,任麗彤,曹連莆,孔廣超

(石河子大學麥類作物研究所,石河子 832003)

六倍體小黑麥耐鹽相關基因cDNA-AFLP技術體系的建立

王白羽,任麗彤,曹連莆,孔廣超

(石河子大學麥類作物研究所,石河子 832003)

為建立和優(yōu)化六倍體小黑麥耐鹽相關基因克隆cDNA-AFLP技術反應體系,并探索其應用效果,以對鹽脅迫反應不同的4個六倍體小黑麥品種(系)為材料,對其在0.15 mol/L氯化鈉脅迫72 h的cDNA-AFLP技術中DNA聚合酶濃度、模版濃度和引物篩選等過程進行了摸索和優(yōu)化。結果顯示,建立了以1.0 U Taq DNA聚合酶為擴增酶、預擴產物稀釋20倍、EcoR I和Mse I為內切酶及其相應接頭為引物的六倍體小黑麥耐鹽相關基因cDNAAFLP技術體系,并從64對引物組合中篩選出穩(wěn)定、高效的引物組合以及236個差異片段。結果表明,該cDNAAFLP技術體系更易分離出差異性片段,為六倍體小黑麥在鹽脅迫及其它逆境環(huán)境下的基因克隆提供一種有效手段。

小黑麥;耐鹽基因;cDNA-AFLP;差異性片段

Abstract:To construct a more efficient cDNA-AFLP system and explore its usage for gene clone related with salt stress in triticale.Four triticale varieties or lines with sensitive or tolerant to salt were used to be stressed by 0.15 mol/L NaCl for 72 hours as materials,the courses of DNA Polymerase concentration,template concentration,primer screening in the cDNA-AFLP technolyge were optimized.The result showed that we constructed the cDNA-AFLP system that 1.0 U Taq DNA polymerase for pre-amplication enzyme,the 20 times of diluted pre-amplication product,EcoR I and Mse I and their realted adapters for primers,and several stable,edible primer combinations were screened out of 64 pairs of primers and 236 differentially expressed cDNAs were obtained with the newly established cDNA-AFLP system.The result indicated that cDNA-AFLP could easily isolate more differential cDNAfragments than usual AFLP techniques and it will provide a powerful method for molecular cloning of genes in triticale related with salt stress.

Key words:triticale;salt stress;cDNA-AFLP;differentially expressed cDNAs

鹽堿是影響全球大田作物持續(xù)生產的主要非生物逆境之一,它影響了作物的正常生長,限制了作物產量潛力的正常發(fā)揮。據(jù)統(tǒng)計,在影響作物產量的各種環(huán)境因素中,干旱和鹽堿所造成的減產損失高達40%以上[1]。全球約有9億hm2的土地存在不同程度的鹽堿化,占世界總耕地面積的20%,其中中國鹽堿土面積約2000萬hm2[2]。因此,如何開發(fā)和利用鹽堿化土壤,提高作物產量和品質已成為鹽堿地農業(yè)、海水灌溉農業(yè)中亟待解決的重要問題[3]。

小黑麥是由小麥和黑麥經屬間人工雜交、應用染色體加倍技術育成的第一個新物種[4]。其不僅具有小麥籽粒高產、優(yōu)質的特性,也繼承了黑麥生物學產量高,對病、蟲害以及干旱、瘠薄、鹽堿等不良環(huán)境條件耐性較強的優(yōu)點。小黑麥的耐鹽堿性及其生物改良鹽堿地的作用日益受到關注[5]。但長期以來人們對小黑麥耐鹽機理知之甚少。從基因表達的差異入手,尋找與小黑麥耐鹽性相關的基因,并對其功能進行分析,對于深入了解小黑麥耐鹽堿機理具有重要的意義。

cDNA-AFLP(cDNA amplifiedfragment length polymorphism)是Bachem等[6]在基因組DNA的選擇性擴增限制性片段即AFLP(amplified fragment length polymorphism)的基礎上創(chuàng)造出來的一種用于RNA指紋分析的方法,該法將 RT-PCR(reverse transcripted PCR)和AFLP技術結合起來,采用 PCR中較高的退火溫度和特定引物對包含信息較多的內部特異片段進行選擇性擴增,從而增加了反應的嚴謹度,使其比 DDRT-PCR(differential display reverse transcriptase PCR)的可靠性和可重復性大大提高[7]。

本研究以六倍體小黑麥為材料,通過對限制性酶切及連接、PCR預擴增、選擇性PCR擴增過程的摸索,旨在優(yōu)化小黑麥耐鹽相關基因cDNA-AFLP技術反應體系,并從中篩選穩(wěn)定、高效的引物組合。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

供試的4個六倍體小黑麥品種(系)為新小黑麥3號、新小黑麥 5 號、98-5981、28ITSN-51,均為石河子大學農學院麥類育種課題組提供。其中新小黑麥3號、新小黑麥5號在前期研究中表現(xiàn)為耐鹽堿品種,而98-5981和28ITSN-51對鹽堿反應表現(xiàn)較為敏感。

本研究使用的脅迫前后的RNA模板為4個品種等比例混合的RNA。

1.1.2 主要試劑

Trizol試劑購自 TIAN GEN生物技術公司(北京),cDNA合成試劑盒購自 Takara生物技術公司(大連)。所用DNA限制性內切酶 EcoRI、MseI以及 T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、接頭及引物都來自購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司的AFLP試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 鹽脅迫處理

將4個小黑麥品種(系)的種子在發(fā)芽盒中進行發(fā)芽,待長到一葉期時,轉至培養(yǎng)盒中用 Hoagland營養(yǎng)液水培7 d左右[8],長至二葉一心后分為2組,一組采用0.15 mol/L氯化鈉脅迫處理72 h,另一組(未脅迫)為對照。

1.2.2 RNA的提取

分別采集經氯化鈉脅迫和對照組的新鮮、幼嫩葉片,利用 Trizol法提取 RNA[9]。

1.2.3 cDNA的獲得

采用反轉錄cDNA合成試劑盒將獲得的RNA合成雙鏈cDNA[10],做為AFLP分析模板。

以管家基因Actin為內參,檢測所合成cDNA模板的質量,正義引物為:GGAAAAGTGCAGAGAGACACG,反義引物為:TACAGTGTCTGGATCGGTGGT[11],擴增出目的片段后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 酶切連接與預擴增模板的制備

采用EcoRⅠ和MseⅠ酶對cDNA樣品進行雙酶切,后用EcoRⅠ和MseⅠ接頭連接,制備預擴增反應模板,并對酶濃度和預擴增模板濃度進行梯度設計。

1.2.6 選擇性擴增

各選用8個 EcoRⅠ和MseⅠ引物,組合成64對選擇性擴增引物,其序列如下:E+CA、E+CT、E+CC、E+CG、E+AG、E+GC、E+AC、E+GG、M+TT、M+TA、M+TC、M+TG、M+AA、M+AT、M+AC、M+AG。

1.2.7 凝膠電泳

選擇性擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳,驗證是否有產物以及產物分子量大小范圍后,采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行擴增產物分離[12]。

1.2.8 銀染顯色

寧夏地處我國西部地區(qū)，是少數(shù)民族聚居區(qū)，也是典型的欠發(fā)達省區(qū)。其中，位于南部地帶的西海固地區(qū)是國家14個集中連片特困地區(qū)之一，也是被習近平總書記深切關注，稱為“苦瘠甲天下”的貧瘠地區(qū)。近年來，寧夏扶貧工作取得顯著成績，但仍有15萬戶建檔立卡貧困戶、58萬建檔立卡貧困人口，且每年因病、因殘致貧高達4萬余戶，每年因病、因災、因意外再次返貧的人口也高達1萬余戶。隨著較易脫貧的人口逐步完成脫貧，扶貧開發(fā)工作邁入“深水區(qū)”，如何解決剩余貧困人口的脫貧問題，成為脫貧攻堅工程的重點。

在文獻[13]中方法的基礎上,對硝酸銀的用量、銀染時間以及顯影的用量及操作作了改進,即銀染液為1.6 g AgNO3+1.5 mL甲醛+1 L去離子水,染色時間為25 min,顯影時間縮短為5 min左右。

2 結果與分析

2.1 cDNA的合成

利用 Trizol法所提取的六倍體小黑麥RNA經電泳分析,結果(圖1)表明:所提取的RNA完整,無拖尾和降解現(xiàn)象,也無明顯的DNA和蛋白質殘留,且其OD260/OD280值均為1.8～2.0。

用反轉錄cDNA試劑盒將RNA反轉錄為雙鏈cDNA,以Actin引物擴增目的片段,電泳后在150 bp出現(xiàn)較亮的條帶(圖2),即Actin基因。這表明所提取的cDNA完整,且其質量良好,同時由 RNA反轉錄合成cDNA獲得了成功,這些均表明由其反轉錄合成的cDNA適于AFLP標記的分析。

圖1 提取的小黑麥RNA的電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis pattern of RNA from tirticale

圖2 合成的cDNA質量電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis pattern of cDNA from tirticale

2.2 Taq DNA聚合酶濃度對預擴增結果的影響

設定4個 Taq DNA聚合酶濃度梯度為0.6、0.8、1.0、1.2 U。由圖3可見,當 Taq DNA 聚合酶為0.8 U和1.0 U時,均在500～250 bp處出現(xiàn)了彌散帶,而在其他濃度時,均沒有擴增到產物。這表明0.8 U和1.0 U的Taq DNA聚合酶較為理想。

在以上 Taq DNA聚合酶濃度的基礎上,最終建立了AFLP預擴增反應體系:2.0μL模板,1.0 μL Pre-ampmix(10μmol/μL),2.5μL 10×Buffer,0.5μL dNTP(2.5 mmol/L),0.5μL Taq DNA聚合酶(2 U/μL),18.5μL水。

反應程序:94℃2 min;94℃30 s,56℃30 s,72℃,80 s,30個循環(huán);72℃5 min。

2.3 模板濃度對選擇性擴增的影響

AFLP技術對模板質量要求較高,而模板DNA的量在數(shù)十倍的范圍內變動都不會對擴增的結果產生明顯影響。如圖4所示,預擴產物在稀釋20倍和50倍后分別作為模板進行選擇性擴增時,擴增結果基本上一致。而稀釋50倍的預擴產物在重復試驗時擴增效果不穩(wěn)定,因此選擇稀釋20倍預擴產物作為模板為宜。

圖3 不同Taq DNA聚合酶濃度預擴電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis pattern for the products of PCR amplification under different Taq DNA polymerase concentration

圖4 預擴產物稀釋不同倍數(shù)的選擴圖譜Fig 4 Electrophoresis pattern for the products of PCR amplification under different preamplication products concentration

在此基礎上建立了適合的AFLP選擇性擴增反應體系:3.0μL模板,0.8μL EcoRⅠ選擴引物(10μmol/L),0.8μL MseⅠ選擴引物 (10μmol/L),2.5μL 10×Buffer,0.45μL dNTP(10 mmol/L),0.31μL Taq DNA 聚合酶(2 U/μL),12.324 μL水。

反應程序:94℃2 min;94℃30 s,65℃30 s,72℃80 s,退火溫度每個循環(huán)降0.7℃、14個循環(huán);94℃30 s;55℃30 s;72℃80 s,23個循環(huán);72℃5 min。

2.4 引物篩選

由圖5可知,E+CC/M+A G、E+CT/M+AG等引物可以擴增出較穩(wěn)定的條帶。圖5還顯示挑選差異片段的5種情況:

1)在鹽脅迫處理和對照中的表達無明顯的差異,如圖5中的第7和第8泳道;

2)某一基因在對照中的表達比在鹽脅迫處理的樣品強,例如圖5中的A指示的譜帶;

3)某一基因在樣品中的表達比對照強,例如圖5中B指示的譜帶;

4)某一基因在對照中表達而在鹽脅迫后不表達,例如圖5中C所指示的譜帶;

5)某一基因鹽脅迫后才表達,而在對照樣品中無表達,例如圖5中的D所指示的譜帶。

圖5 不同引物的聚丙烯凝膠電泳圖譜Fig.5 Polyacrylamide electrophoresis pattern for the products of amplified by different primers

2.5 差異片段比對

經64對引物的篩選共挑選出了236個差異片斷(表1),從中隨機選取100個進行二次擴增,已成功擴增并克隆、測序的差異性片段共33個,其它的可能為假陽性。

表1 篩選出的具差異性引物組合及差異片段數(shù)目Tab.1 The screened different primer combinations and differentially expressed cDNAs

將這33個片段在NCBI中通過Blast-X比對,結果表明:有30個與已知特定基因具有同源性,另有3個未找到具有同源性的已知基因或序列無任何同源性,可能是尚未發(fā)現(xiàn)的新基因。在30個已知基因的同源片段中有5個與耐鹽性密切相關,如磷酸酰絲氨酸脫羧酶、谷氨酰胺依賴天冬酰胺合成酶、碳酸酐酶、抗性蛋白;其余的25個片段分別與高分子量麥谷蛋白基因,光系統(tǒng)II 32kDa蛋白,光系統(tǒng)I疏水蛋白(PSI)等基因具有同源性。

3 討論

在cDNA-AFLP技術中,當轉錄產物高度表達時,擴增條帶強度的高低能直接反應出基因表達量的差別,所獲得的轉錄衍生片段可最大限度的提供基因編碼區(qū)的信息,這使得cDNA-AFLP技術成為一種分離差異表達基因的有效方法[14]。

影響cDNA-AFLP結果的因素有很多,如 Taq DNA聚合酶的濃度、預擴模板的濃度、限制性內切酶的組合等。其中選擇限制性內切酶的組合是最難把握的,因為限制性內切酶要最大限度地覆蓋mRNA池,這樣才可以涵蓋所有表達基因的信息[15],也就要求對作物的遺傳信息有更全面的了解。

本研究建立了以 Trizol法提取RNA、1.0U北京鼎國生物技術有限公司的 Taq DNA聚合酶為與擴增酶、預擴產物稀釋20倍、EcoR I和 Mse I為內切酶及其相應接頭引物為主要技術內容,同時結合增加 AgNO3用量以及縮短顯色時間的cDNAAFLP技術體系。該技術體系比以往在作物上使用的AFLP更易分離出差異性片段,其可靠性和可重復性也有了較大提高[15],同時突破了常規(guī)的銀染染色方法,所得的小黑麥圖譜條帶清晰、背景色淡,其染色結果更利于數(shù)據(jù)的分析。

本實驗利用cDNA-AFLP技術從小黑麥中克隆了一些與鹽脅迫反應相關的cDNA片段,它們有可能在小黑麥的耐鹽中起重要或決定性作用。獲得的這些基因根據(jù)已知的 EST序列進行了部分基因的全長cDNA的克隆,獲取了抗鹽堿相關基因碳酸酐酶,其與在 GenBank公布的大麥碳酸酐酶基因的同源性為79%,這為進一步研究小黑麥鹽堿相關基因奠定了一定基礎。

該cDNA-AFLP技術是首次應用于小黑麥分子標記方面,不僅適合小黑麥逆境環(huán)境下基因的差異性片段分離,也可為研究其它麥類作物通過RNA反轉錄和差顯途徑進行基因分子克隆提供參考。

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Contruction of cDNA-AFLP Technique for Genes Related to Salt Stress in Hexopliod Tirticale

WANGBaiyu,REN Litong,CAO Lianpu,KONG Guangchao
(Institute of Triticeae Crops,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

S512.4

A

1007-7383(2010)04-0404-05

2009-10-11

國家自然科學基金項目(30960194)

王白羽(1984-),女,碩士生,專業(yè)方向為作物高產、優(yōu)質、抗性性狀的育種。

孔廣超(1970-),男,副教授,從事作物遺傳育種研究;e-mail:kgch_agr@shzu.edu.cn。