丁 甜,董慶利,相啟森,吳德渙

(1.上海理工大學食品科學與工程研究所,上海 200093; 2.國立江原大學食品科學與生物技術學科,韓國春川 200701; 3.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院,陜西楊凌 712100)

Listeria monocytogenes在經(jīng)高氧化還原電位酸性水處理的鮮食萵苣上預測模型的建立

丁 甜1,2,董慶利1,相啟森3,吳德渙2,＊

(1.上海理工大學食品科學與工程研究所,上海 200093; 2.國立江原大學食品科學與生物技術學科,韓國春川 200701; 3.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院,陜西楊凌 712100)

采用高氧化還原電位酸性水(EOW)對接種過單核細胞增生李斯特菌的鮮食萵苣進行處理,研究殘留菌在不同溫度下的保存期限。建立 Gompertz,Logistic和Baranyi初級模型,描述單增李斯特菌在不同溫度下的生長情況,對比結果表明,Gompertz模型的判定系數(shù) R2=0.9913,能夠更好地擬合李斯特菌在各個溫度下的生長狀況,并得到李斯特菌生長的 Gompertz模型生長參數(shù)(SGR,LT,MPD)。利用平方根模型對其的最大比生長速率的平方根-溫度進行擬合,得到萵苣上單核細胞增生李斯特菌生長的二級模型： SGR=0.015T+0.069。使用判定系數(shù) (R2)、均方誤差(MSE)、偏差因子(BF)和準確因子(AF)對模型進行驗證,結果表明,本研究得出的二級模型能夠很好地預測單核細胞增生李斯特菌在相應環(huán)境下的生長狀況。

單核細胞增生李斯特菌,高氧化還原電位酸性水,萵苣,預測模型,驗證

1 材料與方法

1.1 實驗材料

高氧化還原電位酸性水 由電解水生成裝置A2-1000(220V,30A,Korean E&S Fist Inc,Seoul, Korea)電解 0.1%氯化鈉溶液得到。當電流設置到12A時,電位酸性水和電位堿性水同時分別從陽極和陰極管中流出,當觀察到有穩(wěn)定的水流從管中持續(xù)流出時,15min后,從陽極管收集實驗所需的高氧化還原電位酸性水 (氯濃度 50μg/mL;pH＜2.7; ORP：1150～1180mV);萵苣 購于當?shù)氐某?GS.Market,Chunchon,Korea),然后立即保存在 4℃的保鮮冰箱中;實驗菌株 L.m onocytogenesScott A、L.m onocytogenesATCC 19116和L.m onocytogenesATCC 19118;中和劑 含 0.5%硫代硫酸鈉的胰蛋白胨生理鹽水溶液。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌液準備 分別取 10μL原種菌液接種到10mL TSBYE(TSB,Difco,Sparks,MD,U.S.A.)培養(yǎng)基中,置于 35℃的恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng) 24h,使菌體細胞濃度大約為 109cfu/mL。然后在 10min,5000×g, 4℃的離心條件下重復離心 2次,得到的菌體用濃度為 0.1%的蛋白胨緩沖溶液 (Buffered peptone water, Difco,USA)沖洗,得到濃度為 109cfu/mL的李斯特菌混合溶液。將上述菌體細胞懸液稀釋到107cfu/mL,保存在 4℃的恒溫箱中備用。

1.2.2 培養(yǎng)基制備 稱取 57.5g牛津培養(yǎng)基 (Oxford medium base),溶于 1000mL純凈水中,連續(xù)緩慢加熱至沸騰,使其充分混合均勻,1min后,在 121℃下滅菌 10min。當冷卻至 45～50℃時,加入 10mL rehydrated oxford ant imicrobic supplement,混合均勻后,制備平板。

1.2.3 樣品的制備 把萵苣外層脫色、萎蔫的部分去掉,只取新鮮的葉子并用消毒的手術刀切成 3cm× 3cm的小片,每次稱取 10g置于無菌的均質(zhì)袋 (Nasco Whirl-Pak,Janesville,W I)中,做好標記后保存在 4℃保鮮冰箱中備用(24h以內(nèi))。將濃度為 107cfu/mL的菌懸浮液接種到萵苣樣品上,使樣品的初始菌數(shù)大致為 105cfu/g。

1.2.4 實驗操作 將接種后的萵苣樣品在常溫下用高氧化還原電位酸性水(EOW)浸泡 3min,轉(zhuǎn)移到新的均質(zhì)袋中,然后加入 90mL經(jīng)高壓滅菌的蛋白胨溶液,進行 2min的破碎處理,使萵苣葉破碎完全,形成懸浮溶液。對處理過的萵苣葉進行菌數(shù)測定,同時判定高氧化還原電位酸性水的殺菌能力。本實驗選定 4、10、15、20、25、30、35℃不同的培養(yǎng)溫度,根據(jù)不同的溫度選定不同的測試時間段,每隔一定時間分別取出一定量樣品進行菌數(shù)測定,取合適稀釋度,用平板計數(shù)法得出活菌數(shù)。

1.2.5 初級模型的建立 利用 GraphPad Pris m (version 4,GraphPad Sof tware,Inc.,San Diego,CA, U.S.A.)和 DMFit(Version2.1.,InstituteofFood Research,Nor wich Research Park Nor wich NR4 7UA, United Kingdom.)統(tǒng)計軟件進行初級模型的擬合,并利用實驗得到的原始數(shù)據(jù)建立 Gompertz[16], Logistic[17]和 Barayi[18]三種初級模型。對三種模型得出的 R2進行比較,選取最能符合實驗數(shù)據(jù)的模型,得出其不同溫度下的生長曲線,得到相應的初級模型參數(shù)。

Gompertz模型：

Logistic模型：

Baranyi模型：

式中：y表示最終菌落數(shù)(log CFU/g);ymax表示生長過程中的最大菌落數(shù) (log CFU/g);y0表示最初菌落數(shù) (log CFU /g);μ表示最大比生長速率(log CFU/h);λ表示延滯期 (h);v是底物的增長速率;A,a,b是模型的參數(shù)。

1.2.6 二級模型的建立 二級模型的擬合使用 SPSS 16.0 package program(Statistical package for the social science,Chicago, IL,USA)統(tǒng)計軟件,研究溫度 (T)對最大比生長速率(SGR)的影響,得到平方根模型。

1.2.7 模型的驗證 在模型的驗證階段,判定系數(shù)(R2)、均方誤差 (Mean Square Error,MSE)、偏差因子 (Bias factor,BF)和準確因子 (Accuracy factor,AF)將被用來作為衡量模型的標準。BF是偏差因子,表示實測值是大于預測值 (bias factor＞1)或者小于預測值(bias factor＜1);AF是精確因子,表示預測值和實測值的偏離度。公式如下：

表 1 Gompertz,Logistic和Baranyi模型在不同溫度下的判定系數(shù)值(R2)

表 2 由 Gompertz模型所得出的李斯特菌在不同溫度下的生長參數(shù)

2 結果與討論

2.1 初級模型的建立

接種后的萵苣葉李斯特菌濃度大約為 5.0 log cfu/g,經(jīng)過 EOW處理后,其濃度大致為 2.9 log cfu/g,說明EOW對李斯特菌的滅活數(shù)為 2.1 log cfu/g,具有很強的殺菌能力。該結果與 Guentzel[18]在 2008年發(fā)表的研究成果相似,他們發(fā)現(xiàn)相同濃度的 EOW在相似條件下對李斯特菌的滅活數(shù)為 2.3 log cfu/g。

將建立的 Gompertz,Logistic和 Baranyi三種模型進行比較,如表 1所示。通過不同模型在各個溫度下的判定系數(shù) R2進行縱向比較,可以看出 Gompertz模型所得 R2值較另外兩個模型更接近 1,并且Logistic模型和Baranyi模型在 30℃時并不能表達李斯特菌的生長曲線,所以選擇 Gompertz模型為本研究的初級模型。

實驗結果表明,不同溫度下李斯特菌的生長曲線和 Gompertz模型的吻合情況良好,Gompertz模型的平均判定系數(shù) R2高達 0.9913,使用 Pris m軟件對原始數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,結果如圖 1所示。在 4℃和10℃的培養(yǎng)條件下,李斯特菌生長非常緩慢,在培養(yǎng)的前 50h,李斯特菌數(shù)目基本維持在初始水平,幾乎沒有出現(xiàn)生長態(tài)勢。隨著溫度的升高,李斯特菌的生長速度也加快,尤其是在 30℃和 35℃,只需要15h,李斯特菌就能生長到穩(wěn)定的水平。初級模型的擬合得到的模型參數(shù)如表 2所示,我們也可以清楚地看到隨著溫度的升高,最大比生長速率 (SGR)和最大菌體密度(MPD)隨之增加,相反,李斯特菌的生長延遲期(LT)縮短。

2.2 二級模型的建立

根據(jù)表 2中得到的不同溫度下的最大比生長速率 (SGR),利用 SPSS統(tǒng)計軟件進行線性回歸分析,從而得到關于溫度和 SGR平方根的二級模型 (如圖2所示)。由圖 2所示,圖中的點分布在 linear周圍很近的地方,說明溫度和李斯特菌的最大比生長速率的平方根有很好的線性關系;R2=0.981,表明二級模型的預測準確度高達 98.1%,校正決定系數(shù)=0.977,說明僅有 2.3%的總變差不能解釋當前的模型[19]。

圖 1 Gompertz模型所描述的李斯特菌在不同溫度下的生長曲線

圖2 二級模型的擬合

平方根模型[20-21]是用來描述環(huán)境因子影響的主要模型,其描述溫度影響的簡單表達式為：

其中,k是生長速率 (The rate of growth),b是回歸系數(shù) (Regression constant),T是溫度 (℃),T0是微生物生長理論最低溫度。由上述實驗數(shù)據(jù)得到李斯特菌在萵苣上生長模型的二級模型為：0.015T+0.069。

2.3 二級模型的驗證

對模型的驗證是一個非常重要的步驟,只有通過了驗證,所建立的模型才會有價值。在本研究中, R2、MSE、BF和 AF用來作為衡量模型的工具,其中BF和 AF被認為是驗證模型的非常有價值的工具[21-24]。用所得的二級模型計算出相應溫度下的預測值,與實驗值進行比較。如圖 3所示,R2值達到0.9769,預測值與實驗值相關性很高。

圖 3 單增李斯特菌預測值和實驗值的相關性分析

Adair[23]等報道,MSE的值越小,說明模型表達實驗數(shù)據(jù)表達得越充分。如表 3所示,MSE的值為0.0003,說明預測值和實驗觀察值非常相似,均方誤差很小,說明該模型能夠很好地擬合實驗數(shù)據(jù)。

表3 二級模型的MSE、AF和BF值

偏差因子(BF)是衡量模型的一個非常重要的參數(shù),Ross[25]認為,對于微生物生長模型的驗證,如果BF值在 0.9～1.05的范圍之內(nèi),認為該模型能夠很好地預測微生物生長速度和生長狀況;如果 BF值在0.7～0.9或者 1.06～1.15范圍之內(nèi),則該模型是可以被接受的;如果BF值大于 1.15或者小于 0.7,則說明該模型是失敗的。由表 3可知,本實驗所得 BF值為1.0398,在 0.9～1.05的范圍之內(nèi),說明建立的模型能夠很好的預測微生物生長速度和生長狀況。當 AF =1的時候,說明模型有很高的精確性,數(shù)值越大或越小,說明該模型的準確性越低。如表 3所示,AF= 1.1068,意味著平均起來將有 10.68%的預測值與實驗值不符,這是一個比較理想,可以接受的結果。Dalgaard和 J?rgensen[26]所建立的關于李斯特菌在各種各樣的海產(chǎn)品中的生長模型,計算得出的AF值在1.4～4.0之間;Ross[25]所建立的葡萄球菌的生長模型,在驗證當中得出了 1.53的 AF值;而 Neumeyer[27]關于假單胞菌的模型驗證中的AF值為 1.3。相比較之下,由于平方根模型本身能夠很好地描述環(huán)境因子對微生物生長的影響,準確因子的值為 1.1068,表明本實驗所建立的模型具有相當高的準確性。

3 結論

3.1 利用高氧化還原電位酸性水 (EOW)處理接種單增李斯特菌的萵苣樣品,得到 EOW對李斯特菌的滅活數(shù)為 2.1log cfu/g,說明高氧化還原電位酸性水(EOW)具有很強的殺菌能力。

3.2 建立了 Gompertz,Logistic和 Baranyi三種初級模型描述單增李斯特菌在不同溫度下的生長情況。對比結果表明,Gompertz模型的判定系數(shù) R2= 0.9913,能夠更好地擬合李斯特菌在各個溫度下的生長狀況。得到得到李斯特菌在萵苣上存生長模型的二級模型為：對模型進行驗證,結果表明,該二級模型能夠很好地預測單核細胞增生李斯特菌在相應環(huán)境下的生長狀況。預測食品微生物學的優(yōu)點在于利用存在的數(shù)據(jù)去預測未來發(fā)展趨勢,對實際生產(chǎn)和流通過程進行監(jiān)控,具有重要的意義,也是未來的安全和質(zhì)量控制的發(fā)展方向之一。綜上所述,通過該研究所得出的關于李斯特菌的生長預測模型具有一定的價值,能夠為將來生活和實驗中李斯特菌的生長情況提供科學的預測。

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Study on predictive modelof the grow th of Listeria monocytogenes in ready-to-eat lettuce treated w ith electrolyzed oxidizing water

D ING Tian1,2,DONG Qing-li1,XI ANG Qi-sen3,W U De-huan2,＊
(1.Institute of Food Science and Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China; 2.Department of Food Science and Biotechnology,Kangwon NationalUniversity,Chuncheon,Gangwon 200701,Korea; 3.College of Food Science and Engineering,NorthwestA&F University,Yangling 712100,China)

The ob jec tive of this s tudy was to obse rve the ant im ic rob ia l effec t of e lec trolyzed oxid izing wa te r(EOW) aga ins tLis te ria m onocytogenes in ready-to-ea t le ttuce,and deve lop p red ic tive m ode ls of the g row th kine tic of L.m onocytogenes le ttuce trea ted w ith EOW.She lf life tes ts we re done a t seven d iffe rent s torage temp e ra tures,and p r im a ry m ode ls(Gomp e rtz,Log is tic and Ba ranyi)we re deve lop ed in orde r to find the bes t-fit m ode l to desc ribe the g row th kine tic of L.m onocytogenes.The comp a rison result ind ica ted tha t Gomp e rtz m ode l could fit the g row th kine tics of L.m onocytogenes bes t a t d iffe rent temp e ra tures w ith a high corre la tion coeffic ient va lue(R2=0.9913). The g row th p a ram e te rs(SGR,LT,M PD)we re ob ta ined us ing Gomp e rtz m ode l.Then SPSS was emp loyed to deve lop the seconda ry m ode l exp ress ing the re la tions be tween squa re root of SGR and temp e ra ture： SGR= 0.015T+0.069.Us ing the ind ices such as M ean Squa re Error(MSE),B ias fac tor(BF),Accuracy fac tor(AF)to va lida te the currentm ode l,the results dem ons tra ted tha t the m ode l deve lop ed was qua lified enough to p red ic t the g row th of L.m onocytogenes in p rac tice in the future.

L.m onocytogenes;e lec trolyzed oxid izing wa te r;le ttuce;p red ic tive m ode l;va lida tion

TS201.3

A

1002-0306(2010)03-0087-05

單核細胞增生李斯特菌 (單增李斯特菌,L isteria m onocytogenes,Lm)是一種分布廣泛的食源性病原菌,人感染后能引發(fā)腦膜炎、發(fā)熱性敗血性胃腸炎等臨床癥狀,感染后發(fā)病死亡率約為 25%[1-2]。單增李斯特菌廣泛存在于自然界土壤、水、植物和反芻動物、人的糞便中,主要是通過污染乳制品、畜禽產(chǎn)品、生熟肉、蔬菜引起人類致病,由于該菌在 4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖[3],所以它是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。近幾年來,因食品污染單增李斯特菌而引起的食物中毒暴發(fā)事件日見增多,已引起國際社會的廣泛關注[4-5]。因此,2000年 WHO食品安全工作計劃將單增李斯特菌列為必檢的食源性致病菌之一。預測食品微生物學 (Predictive Food Microbiology)是運用微生物學、數(shù)學、統(tǒng)計學和應用計算機學建立起來的新興學科[6-7]。它的主要研究內(nèi)容是利用數(shù)學模型定量描述和預測微生物在特定食品特性 (pH、水分活度等)和加工流通環(huán)境因子(溫度、包裝氣體等)條件下生長和存活的模型[7]。預測食品微生物學在食品安全的預測和管理中有很大的應用價值,可以用來預測食品的貨架壽命和微生物學安全,同時是管理食品安全的重要工具,它為微生物風險評估 (Quantitative M icrobial Risk Assess ment,QMRA)和 HACCP(HazardAnalysis Critical Control Point)提供了科學依據(jù)[9-10]。高氧化還原電位酸性水 (Electrolyzed Oxidizing Water, EOW),是用強電解水生成裝置電解食鹽水而成的具有高電位強氧化性和 pH在 2.0～3.5的酸性水[11]。高氧化還原電位酸性水具有無毒、不污染環(huán)境、殺菌效果好等特點,在醫(yī)療衛(wèi)生、農(nóng)作物、家畜和食品等諸多領域具有很好的應用前景[12-15]。本文研究高氧化還原電位酸性水(EOW)處理對萵苣樣品中單增李斯特菌的殺菌效果,并建立了單核細胞增生李斯特菌在萵苣上的生長預測模型,經(jīng)驗證,所得模型能夠很好地表達單核細胞增生李斯特菌的生長狀況,具有一定的應用價值,并能對將來生活和實驗中李斯特菌的生長做出可靠的科學預測。

2009-04-08 ＊通訊聯(lián)系人

丁甜(1985-),男,博士研究生,研究方向：食品微生物風險評估。

國家自然科學基金 (30800864)。