肖 超,吳新榮,＊

(1.華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640; 2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥學部,廣東廣州 510010)

紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體的制備及其性質(zhì)研究

肖 超1,2,吳新榮1,2,＊

(1.華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640; 2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥學部,廣東廣州 510010)

采用超聲薄膜分散法制備紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體。通過正交設計優(yōu)化制備工藝,以包封率和分布情況等為綜合考察指標。結果表明,最佳處方和工藝條件為：卵磷脂∶膽固醇為 6∶1,紫杉醇∶(卵磷脂 +膽固醇)為 1∶30,超聲時間40min,磁粉∶紫杉醇為2∶1,吐溫-80∶紫杉醇為 4∶1,聚乙二醇-800∶磁粉為 8∶1。制備的紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體包封率最高可達 84.4%±1.7%,平均粒徑 150±20nm。該方法制備的紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體包封率較高,分布均勻,符合靶向制劑的要求。

紫杉醇,磁性納米脂質(zhì)體,包封率,正交實驗

1 材料與方法

1.1 材料與設備

紫杉醇原藥 含量 99%以上,批號 CP-01-081201,福建南方生物技術股份有限公司;紫杉醇對照品 含量 99.5%,批號 1534-200202,中國藥品生物制品檢驗所;大豆卵磷脂、吐溫-80 廣州威佳科技有限公司;膽固醇、色譜純甲醇、聚乙二醇-800美國 Sigma公司;丙酮 天津市紅巖試劑廠;四氧化三鐵納米磁粉 焦作伴侶納米材料工程有限公司;氨水、油酸、無水乙醇 廣州化學試劑廠,均為分析純。

ZFQ-85A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海醫(yī)械專機廠;電熱恒溫水浴鍋 上海錦萍儀器儀表有限公司; DL-720A超聲波清洗儀 上海之信儀器有限公司; SHZ-D(III)型循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司;ALc-210分析天平 美國ACCULAB公司;TP-320A電子天平 湘儀天平儀器設備有限公司;AXLC1805超純水機 廣州億鑫生物科技有限公司;高效液相色譜儀 Waters2487系統(tǒng),美國Waters公司;H-600型電子透射顯微電鏡 日本日立公司;截留分子量 3500透析袋 美國Viskase公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體的制備方法 稱取處方量大豆卵磷脂和膽固醇,溶于適量無水乙醇中,攪拌至完全溶解,置于磨口圓底燒瓶中,55℃恒溫水浴減壓蒸去無水乙醇,使膜材在燒杯壁上形成均勻類脂薄膜,另將處方量的紫杉醇原料藥溶于無水乙醇并溶解類脂膜,混勻振蕩制得類脂溶液;然后加入一定量的油酸改性的納米磁粉、溶有聚乙二醇 -800的 PBS (pH7.4)和吐溫-80,超聲分散,55℃(100r·min-1)條件下,再次減壓蒸發(fā)約 2h除去有機溶劑,待達到膠態(tài)后,向燒瓶內(nèi)吹氮氣流 30min,使有機溶劑完全清除,繼續(xù)旋轉(zhuǎn)至溶液由乳白色變?yōu)闇\黑色半透明狀類脂即得[3-4]。

1.2.2 紫杉醇納米脂質(zhì)體制備實驗設計

1.2.2.1 紫杉醇納米脂質(zhì)體制備單因素實驗設計參考相關文獻并結合實驗室的制備方法,擬選取影響制備紫杉醇納米脂質(zhì)體性質(zhì)的單因素為：磷脂和膽固醇的質(zhì)量比 (A)、藥物和脂類的質(zhì)量比 (B)、超聲時間 (C)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的水浴溫度 (D)[5],并取如下的水平 (以下比例均為質(zhì)量比)：

卵磷脂∶膽固醇為 9∶1、6∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶6、1∶9;紫杉醇∶(卵磷脂 +膽固醇)為 1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10、1∶5;超聲時間為 10、20、30、40、50、60min;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的水浴溫度為 30、40、45、50、55、60、70℃。

1.2.2.2 紫杉醇納米脂質(zhì)體制備正交實驗設計 根據(jù)單因素和預實驗結果,在影響紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體的粒徑大小及分布和包封率的因素中,磷脂和膽固醇的質(zhì)量比 (A)、藥物和脂類的質(zhì)量比 (B)、超聲時間(C)為主要因素,而旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)水浴溫度為次要因素。因此設立A、B、C 3個考察因素,每個因素選擇 3個水平,選用正交表 L9(34)考察制備紫杉醇納米脂質(zhì)體的最優(yōu)工藝條件,因素水平如表 1。

表 1 紫杉醇納米脂質(zhì)體正交實驗因素水平表

1.2.3 紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體制備實驗設計

1.2.3.1 紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體制備單因素實驗設計 按上述正交實驗得到的最佳條件制備紫杉醇脂質(zhì)體,并參考相關文獻,對磁粉添加量、吐溫-80添加量和聚乙二醇-800的添加量對添加磁粉后的紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體的性質(zhì)影響做單因素實驗[6],選取如下水平：

磁粉∶紫杉醇為 6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5;吐溫-80∶紫杉醇為 10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2;聚乙二醇-800∶磁粉為 1∶1、3∶1、5∶1、8∶1、10∶1、12∶1、15∶1。

1.2.3.2 紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體制備正交實驗設計根據(jù)單因素和預實驗結果,設立A(磁粉∶紫杉醇)、B(吐溫-80∶紫杉醇)、C(聚乙二醇∶磁粉)3個考察因素,選用正交表 L9(34)進行考察,因素水平如表 2。

表 2 紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體正交實驗因素水平表

1.2.4 評價方法

1.2.4.1 RP-HPLC測定紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體包封率和載藥率 稱取一定量凍存(4℃)產(chǎn)品,加入色譜純甲醇溶解,充分振蕩混勻,經(jīng)高速離心后取上清液,向離心沉淀物中再加入色譜純甲醇,充分搖勻再離心,將兩次上清液合并,吸取約 1mL加入高效液相色譜儀進樣管,振蕩片刻,按順序擺放,用反相高效液相色譜法分析[7]。

液相色譜的條件為：色譜柱：迪馬 C18ODS色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相：甲醇-水 (7∶3);柱溫：30℃;流速：1.0mL·min-1;進樣量：20μL;紫外檢測波長：228nm;進樣時間：20min;紫杉醇標準品做對照。

包封率和載藥量按以下公式計算：

1.2.4.2 顯微形態(tài)觀察 取少量紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體混懸液滴至專用銅網(wǎng)上,37℃電熱干燥箱內(nèi)烘干 5min,使粒子在銅網(wǎng)上濃縮沉積,用透射電子顯微鏡進行觀察粒徑大小和分布情況,并攝制照片[8]。

1.2.4.3 體外釋藥實驗 分別精密吸取紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體、空白脂質(zhì)體、同質(zhì)量濃度的紫杉醇溶液5.00mL至V ISK ING透析袋中,放入 100mL介質(zhì) (乙腈-水 =47∶53的溶液)中,置于恒溫 (37±1℃)水浴中。于 0.25、0.5、1、2、4、8、10、12、14、16、18、20、24、30、33、36、44、48h吸取介質(zhì) 5.00mL,同時補充相同介質(zhì) 5.00mL,分別以空白脂質(zhì)體透析液和釋放介質(zhì)為參照,應用紫外分光光度法,于 228nm處測定不同時間點含藥磁性脂質(zhì)體和原料藥物溶液透析出游離藥物的紫外吸收,求算藥物濃度和累積釋放量,繪制含藥脂質(zhì)體和原料藥累積釋藥曲線[9]。

2 結果與討論

2.1 正交實驗結果及制備方法的確定

2.1.1 紫杉醇脂質(zhì)體制備的正交實驗結果 如表 3所示。

表 3 紫杉醇納米脂質(zhì)體制備正交實驗結果

表 4 紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體制備正交實驗結果

由以上正交實驗結果,結合實際需要,得到最佳制備紫杉醇脂質(zhì)體的條件是：卵磷脂∶膽固醇 =6∶1,紫杉醇∶(卵磷脂 +膽固醇)=1∶30,超聲時間 40min。

2.1.2 紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體制備的正交實驗結果如表4所示。

由以上正交實驗結果得到最佳的制備紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體的條件是：磁粉∶紫杉醇 =3∶1,吐溫-80∶紫杉醇 =4∶1,聚乙二醇-800∶磁粉 =8∶1,考慮到對磁粉量的實際需求,采用磁粉∶紫杉醇 =2∶1。則最終的制備紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體的最佳配方及相關條件是：卵磷脂∶膽固醇 =6∶1,紫杉醇∶(卵磷脂 +膽固醇)=1∶30,超聲時間 40min,磁粉∶紫杉醇 =2∶1,吐溫-80∶紫杉醇 =4∶1,聚乙二醇-800∶磁粉 =8∶1。

對于第一步的紫杉醇脂質(zhì)體的制備,由正交分析得到三個因素中對于紫杉醇脂質(zhì)體的包封率及其粒徑分布貢獻的大小依次是：卵磷脂∶膽固醇的比例＞紫杉醇∶(卵磷脂 +膽固醇)的比例 ＞超聲時間。表 3中的綜合評分是包封率和顆粒分布的評分的平均值,其中顆粒分布感官評定的評分標準是：分散不均勻、分散相對均勻但有較多的聚集存在、分散相對均勻有較少的聚集存在、分散均勻,分別給分 80～100之間(約值)。單因素實驗結果分別為：卵磷脂∶膽固醇 =4∶1,紫杉醇∶(卵磷脂 +膽固醇)=1∶30時藥物的綜合評分最高,超聲時間達到 40min時綜合評分已經(jīng)很高,再延長時間基本沒有增長。

對于第二步紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體的制備,正交實驗的結果可以看出,三個因素中對紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體的包封率及其相對穩(wěn)定性貢獻的大小依次是：磁粉的添加量 ＞聚乙二醇-800的添加量 ＞吐溫-80的添加量。表 4中的綜合評分是包封率和短期穩(wěn)定性的評分的平均值,其中短期穩(wěn)定性的評分標準是：將制得的紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體在常溫下放置,每天觀察三次,持續(xù)一個月,根據(jù)出現(xiàn)分層時間的長短來評分,出現(xiàn)分層時間越短分數(shù)越低,反之越高,并且以出現(xiàn)分層時間最長的為 100分,其他的按相對最好的比例給分(約值)。單因素的實驗結果分別為：磁粉∶紫杉醇 =2∶1,吐溫-80∶紫杉醇 =6∶1,聚乙二醇-800∶磁粉 =5∶1時藥物的綜合評分最高。

2.1.3 最佳條件制得的紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體包封率及其顯微觀察 按照正交實驗確定的實驗條件制備紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體,并依照上述藥物包封率和載藥量的測定方法測定,得到其最佳包封率約為87.1%,載藥率約為 1.8%。顯微形態(tài)可見外觀圓整,粒度分布均勻,平均粒徑在 150nm左右,多為球形或類球形具比較清晰的脂膜包裹結構,為小單室脂質(zhì)體(圖 1)。

圖1 最佳條件制備的紫杉醇磁性磁性納米脂質(zhì)體(30000倍)

2.1.4 體外釋藥實驗結果 實驗結果(圖 2)表明,紫杉醇原料藥溶液的累積釋藥速率較快,在前 6h幾乎呈直線增長速率,6h時藥物累積釋放百分率為71.1%,48h時可達到 92.7%;而相同時間內(nèi)紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體的累積釋放量遠低于原料藥溶液,6h時僅為 20.2%,48h時僅為 36.1%,并且它的釋藥速率一直比較緩慢,說明紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體相對原藥具有明顯的長效緩釋的效果。

圖2 紫杉醇原藥和紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體的體外釋放曲線

2.2 討論

制備紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體,所需組分較多,影響的因素也較多,正交實驗是選取了其中最重要的幾個因素的優(yōu)化實驗,并且由于第一部分是紫杉醇脂質(zhì)體的合成,第二部分是加進磁粉后的改性,兩部分的評價標準也有不同之處,所以采用兩步正交實驗設計更合理一些。本實驗發(fā)現(xiàn)超聲對粒徑大小有比較大的作用,超聲時間合適,就能形成分布均勻、大小相近的囊泡,時間過短起不到好的分散效果,但是也不宜過長,因為過度超聲還會引起脂質(zhì)體膜結構破裂、藥物滲漏,同時亦會使溫度升高,影響含藥脂質(zhì)體的穩(wěn)定性;聚乙二醇的加入對磁粉的穩(wěn)定和均勻都能起到比較好的作用,并且它的存在除了對磁性紫杉醇體系的表面改性幫助脂質(zhì)體分散外,還能增強脂質(zhì)體在體內(nèi)靶點部位的聚集,加強脂質(zhì)體的滲透性和滯留效果;吐溫-80的作用主要體現(xiàn)在輔助改性形成微乳體系。

體外釋放實驗表明,紫杉醇藥物溶液在 8h內(nèi)的累積釋藥量即達到了約 87.7%,而脂質(zhì)體的釋藥速率明顯減慢,8h內(nèi)的累積釋藥量只有 24.7%,48h時僅為 36.1%,這也表明了透析膜對藥物進入釋放介質(zhì)有一定阻礙,但并不是緩釋的主要因素[10],而是由于紫杉醇脂溶性強,能夠包封于脂質(zhì)體的磷脂雙分子層內(nèi),因此減慢了藥物進入釋放介質(zhì)的速度,對阻礙藥物釋放起到了決定性的作用,從而證明了磁性脂質(zhì)體的緩控釋的效果。

磁性藥物靶向治療是近年來發(fā)展的一種新的腫瘤治療方法,它可以降低藥物用量,將藥物最大量地集中在靶部位,同時借助磁性納米粒的栓塞和磁場下的磁響應性可以進一步加強治療作用。但要將其應用于臨床,還要進行一系列的深入研究：優(yōu)化磁靶向性脂質(zhì)體納米粒制備工藝,以期達到更好的控釋效果,并使其穩(wěn)定性能更適合臨床用藥和工業(yè)生產(chǎn);尋找合適的脂質(zhì)體干燥方法,以延長粒子保存期;配套的磁場產(chǎn)生裝置的研制等。

3 結論

薄膜分散法可以較簡便地制得紫杉醇磁性納米脂質(zhì)體,并且正交設計的優(yōu)化使所得產(chǎn)品分布相對均勻,粒徑大小合適,體外釋放效果也不錯。其藥物包封率最高可達 87.1%,平均粒徑為 150±20nm,釋藥速率明顯減慢,8h內(nèi)的累積釋藥量只有 24.7%, 48h時僅為 36.1%,基本滿足靶向制劑的要求。

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Preparation and character evaluation of paclitaxelm agnetic nanoparticle liposom es

XI AO Chao1,2,W U Xin-rong1,2,＊
(1.College ofLight Industry and Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China; 2.Department of Phar macy,General Hospital of GuangzhouMilitary Command,Guangzhou 510010,China)

The ultrasound m em b rane d is integ ra tion m e thod was used to p rep a re the p ac litaxe l m agne tic nanop a rtic le lip osom e.Through the orthogona l des ign,the m e thod was op t im ized w ith encap sula tion ra tio and d is tribution cond itions as the m os t result technique p a ram e te rs.The results ind ica ted tha t the idea l com b ina tion of p rep a ra tion and form ula tion we re as follows：lec ithin∶choles te rol=6∶1,p ac litaxe l∶(lec ithin+choles te rol)=1∶30,the t im e of ultrasound was40m in,m agne tic p owde r∶p ac litaxe l=2∶1,tween-80∶p ac litaxe l=4∶1,p olye thylene-800∶m agne tic p owde r=8∶1.The ave rage encap sula tion effic iency of the op t im ized lip osom e was84.4% ±1.7%,the ave rage p a rtic le s ize was150±20nm.The thin fi lm ultrasonic m e thod and the op t im ized p rep a ra tion can be used to p rep a re p ac litaxe lm agne tic nanop a rtic le lip osom e successfully w ith high encap sula tion effic iency and good g ra in s ize.

p ac litaxe l;m agne tic nanop a rtic le lip osom e;enve lop e ra te;orthogona l des ign

TS201.2

A

1002-0306(2010)03-0162-05

紫杉醇是一種廣譜有效的抗腫瘤藥物,國際上目前已用于多種惡性腫瘤的一線治療,并取得了較好的療效[1]。但是因為紫杉醇水溶性很差,早前多用聚氧乙基代蓖麻油與無水乙醇的混合溶液作為溶酶來溶解它,這樣臨床用藥前就必須預先給予患者大劑量的塞米松及 H2受體拮抗劑,以減輕由混合溶媒所引發(fā)的過敏反應及胃腸道反應,給病人帶來不必要的痛苦的同時,也給臨床用藥帶來不便。為了改進上述缺點,近年來開始嘗試采用包埋的手段進行給藥。本實驗設計采用脂質(zhì)體來包封藥物[2],并加入四氧化三鐵納米磁粉制成磁性納米脂質(zhì)體,這樣就可以結合外加磁場作用使藥物定向輸送到靶向病灶部位,降低藥物在正常組織的分布,減輕其對正常組織的毒副作用,提高藥物靶向治療效果。

2009-05-25 ＊通訊聯(lián)系人

肖超(1984-),男,碩士研究生,研究方向：糖類物質(zhì)及其藥物的制備與生物利用。

廣州市科技計劃項目(2005Z3-D2071)。