陳士華吳興泉張 慧曹 健

(河南工業(yè)大學(xué)1，鄭州 450001)

(中原工學(xué)院2，鄭州 450007)

嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制分析

陳士華1吳興泉1張 慧1曹 健2

(河南工業(yè)大學(xué)1，鄭州 450001)

(中原工學(xué)院2，鄭州 450007)

對(duì)嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行了定位，證明該基因?yàn)閱雾樂醋咏Y(jié)構(gòu)。分析該酶的代謝途徑證明亞油酸異構(gòu)酶單獨(dú)處于一條分支途徑，無(wú)其他的酶與之協(xié)同作用。分析四種乳酸菌亞油酸異構(gòu)酶基因的上游調(diào)控區(qū)，發(fā)現(xiàn)了12個(gè)保守位點(diǎn)，可能在亞油酸誘導(dǎo)基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用。確定該蛋白N端無(wú)信號(hào)肽存在，但在N端25(27)～42位存在跨膜區(qū)，取向略微傾向于由外向內(nèi)。證明嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶的密碼子偏好性與大腸桿菌的存在一定差異，可能影響亞油酸異構(gòu)酶基因的表達(dá)，并提出了改造方案。

嗜酸乳桿菌 亞油酸異構(gòu)酶 基因表達(dá) 機(jī)制

亞油酸異構(gòu)酶可催化亞油酸轉(zhuǎn)化為共軛亞油酸(Coniugated linoleic acid，CLA)，而共軛亞油酸是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種功能性脂肪酸，是具有共軛雙鍵的十八碳二烯酸的統(tǒng)稱。研究表明，CLA具有諸多的生理功能，如抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抑制脂肪積累、促進(jìn)生長(zhǎng)、激活免疫等。目前，利用化學(xué)異構(gòu)法制備可食用的達(dá)到營(yíng)養(yǎng)要求的共軛亞油酸產(chǎn)品很困難，且成本高、價(jià)格昂貴，而利用生物技術(shù)方法(即利用亞油酸異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化法)生產(chǎn)CLA產(chǎn)品完全可以克服這些缺點(diǎn)，且生產(chǎn)出的共軛亞油酸組成單一，能夠達(dá)到食品級(jí)保健食品的要求［1－5］。

亞油酸異構(gòu)酶可將雙鍵在C－9和C－12位上的亞油酸(Linoleic Acid，LA)特異的轉(zhuǎn)化為雙鍵在C－10和C－12或C－9和C－11位上的共軛亞油酸［6］。Lin等［7］對(duì)嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、德氏乳酸乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌等菌株所產(chǎn)亞油酸異構(gòu)酶的研究證明:嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化LA為CLA的產(chǎn)率最高，因此，嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶引起了很多學(xué)者的關(guān)注。目前，關(guān)于嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶的發(fā)酵生產(chǎn)、分離純化、酶學(xué)特性等方面已取得了豐富的研究成果［8］。亞油酸異構(gòu)酶的基因已被克?。?］，并證明該酶基因的表達(dá)受亞油酸的誘導(dǎo)，表達(dá)效率較低，但其原因尚未探明，而且關(guān)于該酶基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)理的研究報(bào)導(dǎo)極少，為此開展了本項(xiàng)目研究。

1 分析方法

1.1 乳酸菌亞油酸異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)錄區(qū)的定位及序列分析

利用已克隆的嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因序列，采用http://www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)Blast工具檢索獲得嗜酸乳桿菌全基因組序列及該基因的位置。然后確定該基因上、下游序列，利用NNPP軟件分析啟動(dòng)子位置。采用同樣方法獲得羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌、瘡疤丙酸桿菌的亞油酸異構(gòu)酶基因上游調(diào)控區(qū)，通過(guò)Clustal軟件對(duì)四種乳酸菌亞油酸異構(gòu)酶基因上游調(diào)控區(qū)進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.2 信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu)分析

采用SignalP軟件對(duì)嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶蛋白質(zhì)序列中信號(hào)肽的位置及切割位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，選擇ExPASy Proteomics tools中的TMpred工具，預(yù)測(cè)其跨膜區(qū)段及取向。

1.3 密碼子偏好性分析

通過(guò)密碼子偏好性分析繪圖網(wǎng)站http://gcua.schoedl.de/index.html中的each codon vs.usage table功能網(wǎng)頁(yè)進(jìn)行，輸入嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶的基因序列后，選擇大腸桿菌(Escherichia coli)為宿主表達(dá)系統(tǒng)，提交獲得該基因和大腸桿菌密碼子偏好性的對(duì)比結(jié)果。

1.4 嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶代謝途徑分析

在KEGG主頁(yè)(http://www.genome.jp/kegg/)上方的搜索欄中輸入嗜酸桿菌亞油酸異構(gòu)酶的國(guó)際酶學(xué)編號(hào)EC5.2.1.5后，獲得該酶的信息列表，并進(jìn)行整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因組定位

利用已克隆基因序列檢索Genbank獲得嗜酸乳桿菌全基因組序列(NC 006814.2)，在該基因組中，亞油酸異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)基因序列位于634 806～636 581 bp間。該基因組公布時(shí)，未明確其具體功能，但發(fā)現(xiàn)其編碼蛋白具有肌凝蛋白交叉反應(yīng)抗原(myosincrossreactive antigen)特征，因此命名為 myosincrossreactive antigen基因。

2.2 嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)錄區(qū)特征分析

2.2.1 嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)錄區(qū)的定位

分析發(fā)現(xiàn)在嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因與其上、下游基因間存在非編碼區(qū)，而該基因下游轉(zhuǎn)錄區(qū)的讀碼方向與該基因相反，因此可確定該基因獨(dú)享一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄區(qū)，為單順反子結(jié)構(gòu)。一般原核基因中功能相關(guān)的基因會(huì)以多順反子的形式存在于一個(gè)轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)，共同表達(dá)完成一個(gè)特定的功能，類似亞油酸異構(gòu)酶基因的單順反子結(jié)構(gòu)在原核生物中較少見。

2.2.2 嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的定位

嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因上游106 bp的非編碼區(qū)序列為Atttatttagcaaaattggttaatttcttgcatatagaaagcgctttttttacaataagaatatgtaatataaaactatacttatacaggaaaagaggacatcttt。利用NNPP軟件分析證明該序列中可能成為啟動(dòng)子的序列可能有三段(表1)。

表1 NNPP軟件預(yù)測(cè)啟動(dòng)子序列

其中，第3段位于42～87 bp間，得分為滿分1，在三段中其得分最大，即成為啟動(dòng)子的可能性最大。分析發(fā)現(xiàn)該序列區(qū)49～54 bp間的tttaca序列符合－35區(qū)特征，間隔22 bp后出現(xiàn)的tatact序列符合－10區(qū)結(jié)構(gòu)特征，原核生物的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)多為A，分析發(fā)現(xiàn)在－10區(qū)下游第9個(gè)核苷酸恰好為A，應(yīng)為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。由上述分析可以確定42 bp至87 bp間應(yīng)為亞油酸異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游第2至第7個(gè)核苷酸為aagagg，該序列位于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)位點(diǎn)和基因起始密碼子atg間，符合原核生物SD序列特征，該區(qū)在基因翻譯中可與核糖體小亞基相互識(shí)別定位。

該啟動(dòng)子主要元件如圖1所示:

圖1 NNPP軟件預(yù)測(cè)啟動(dòng)子序列

利用Blast軟件在Genbank中尋找與上述106 bp的非編碼區(qū)序列具有較高相似性的DNA序列，搜索得到多條相似序列，其中除本研究中的來(lái)自嗜酸乳桿菌的DNA序列外，其他相似序列均來(lái)自“斑變形蟲、果蠅、馬魚、小鼠、人類”等真核生物，可以匹配的相似序列的長(zhǎng)度也較短(小于28 bp)。由此可見，在原核生物中該啟動(dòng)子序列未見報(bào)導(dǎo)，說(shuō)明關(guān)于該基因的表達(dá)特性目前尚無(wú)研究。

2.3 四種乳酸菌亞油酸異構(gòu)酶基因上游序列對(duì)比分析

采用2.1中的方法對(duì)嗜酸乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌和瘡皰丙酸桿菌的亞油酸異構(gòu)酶的基因進(jìn)行了基因組定位，明確各菌株亞油酸異構(gòu)酶基因上游區(qū)序列。嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因上游區(qū)序列為:atttatttagcaaaattggttaatttcttgcatatagaaagcgctttttttacaataagaatatgtaatataaaactatacttatacaggaaaagaggacatcttt;羅伊氏乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因上游區(qū)序列為:ttttatccttcctcatatcaatattactcaactaattataagcgtttttgttaaattctaaaccattattttatttcccgggaaatcatctcgagaaagcgctacaatataactgtagattacccgattgcttttcctgaaaggagatcctttt;植物乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因上游區(qū)序列為:tttgaacggttagttaaaataaaaagtgagccgtctgcatttgtcaaggctcgctttttgcatacataaatggcagaacttgtggtgggaatgagccgcttgaaaaaatgtaatatttgttaaaggcaatgtgtttaattggagaaaagtcatcaaatggtgttacgctatgggcagaaattggttgactagcgcaaatattaagaaagcggcaagaaaacaaaaaagttcagttcaaactagacaatcactatccaagttgtataatgtacttgtaagcgttatcagaacctaattacct -att;瘡皰丙酸桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因上游區(qū)序列為: gatctttcgcgacctagaccattaccgaccccattcatcgccga-acttattcaccactacatcgacaaggaagaacg。運(yùn)用Clustal X軟件進(jìn)行完全比對(duì)，結(jié)果表明:以嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因上游調(diào)控序列為基準(zhǔn)，在序列的第15 bp(A)，20 bp(T)，28 bp(T)，49 bp(T)，58 bp(A)，63 bp(A)，73 bp(A)，75 bp(A)，87 bp(C)，90 bp(G)，92 bp(A)，93 bp(A)等處存在四種酸乳菌共有的保守位點(diǎn)，可能在亞油酸誘導(dǎo)該基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用。

2.4 蛋白質(zhì)表達(dá)后的細(xì)胞定位分析

利用SignalP－NN軟件對(duì)該蛋白質(zhì)信號(hào)肽序列進(jìn)行了分析，結(jié)果表明該蛋白質(zhì)N端存在酶切位點(diǎn)的可能性較低，可以確定該蛋白N端無(wú)信號(hào)肽存在。(原文中此處的文字刪去)

圖2 TMpred跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

選擇ExPASy Proteomics tools中的TMpred工具，輸入嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶蛋白質(zhì)序列，預(yù)測(cè)其跨膜區(qū)段及取向。該軟件預(yù)測(cè)結(jié)果得分在500以上的才視為顯著，結(jié)果如圖2所示。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該酶蛋白可能存在的跨膜區(qū)段有2個(gè):1個(gè)由內(nèi)向外(即C端在膜外)的跨膜區(qū)，位于27～42位(得分1 409);1個(gè)由外向內(nèi)(即N端在膜外)的跨膜區(qū)，位置在25～42位(得分1 565)。綜合分析其跨膜拓?fù)淠Ｐ褪?位置在25(或27)～42位間，共18(16)個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)，取向略微傾向于為由外向內(nèi)，屬于膜蛋白。

2.5 密碼子偏好性分析

利用密碼子偏好性分析繪圖網(wǎng)站，對(duì)嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶在大腸桿菌宿主系統(tǒng)中表達(dá)的密碼子偏好性作對(duì)比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因中有以下兩個(gè)密碼子AAG(編碼Lys)和CTT(編碼Leu)的使用情況可能會(huì)影響產(chǎn)物的表達(dá)，如果把AAG定點(diǎn)突變?yōu)锳AA，CTT突變?yōu)镃TG則該基因在大腸桿菌中成功表達(dá)的可能性較大。

2.6 嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶代謝途徑分析

在KEGG網(wǎng)站(http://www.genome.jp/kegg/)中查詢可獲得嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶的催化反應(yīng)類型、底物、產(chǎn)物等相關(guān)信息。查看該酶所在的代謝途徑(圖3)可知，嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶(EC5.2.1.5)單獨(dú)處于一條分支途徑上，能獨(dú)立的催化亞油酸轉(zhuǎn)化為順－9，反－11－共軛亞油酸，上下游沒有其他的酶與之協(xié)同作用。

圖3 亞油酸代謝途徑

3 討論與結(jié)論

對(duì)嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行了定位，證明該基因?yàn)閱雾樂醋咏Y(jié)構(gòu)。分析該酶的代謝途徑證明亞油酸異構(gòu)酶單獨(dú)處于一條分支途徑上，無(wú)其它的酶與之協(xié)同作用，這就將嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因少見的單順反子結(jié)構(gòu)與該酶能獨(dú)立催化異構(gòu)反應(yīng)的功能聯(lián)系起來(lái)。采用了將基因組信息和蛋白質(zhì)在代謝網(wǎng)絡(luò)中的功能聯(lián)合分析的方法，研究了酶的性質(zhì)功能和表達(dá)調(diào)控機(jī)制，也為相關(guān)研究提供了一條具有參考價(jià)值的思路。另外，分析發(fā)現(xiàn)四種乳酸菌亞油酸異構(gòu)酶基因的上游調(diào)控區(qū)共同存在12個(gè)保守位點(diǎn)，可能在亞油酸誘導(dǎo)基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用。

［1］Pawdi PW.Conjugated linoleic acid and other minogenic agents of Bovine milk［J］.Journal of Dairy Science，1999，82 (6):1339－1349

［2］Park Y，Ha YL，Pariza MW.pi－Complex formation of conjugated linoleic acid with iron［J］.Food Chemistry，2007，100 (3):972－976

［3］Park Y，Pariza MW.Mechanisms of body fat modulation by conjugated linoleic acid(CLA)［J］.Food Research International，2007，40:311－323

［4］Chin SF，Storkson JM.Conjugated linoleic acid is a factor for rats as shown by enhanced weight and improved efficency feed［J］.Journal of Nutrition，1994，124:2344－2349

［5］Cook ME，Miller CC，Park Y，et a1.Immunemodulation by altered nutrient metabolism:Nutritional control of inmmne－induced growth［J］.Poultry Science，1993，72:1301－1305

［6］Jun O，Kenji M.Conjugated linoleic acid accumulation via 10－h(huán)ydroxy－12－octadecaenoic acid during microaerobic transformation of linoleic acid by lactobacillus acidophilus［J］.Applied and Environmental Microbiology，2001，67:1246－1252

［7］Lin TY，Lin CW，Lee CH.Conjugated linoleic acid concentration as affected by lactic cultures and added linoleic acid［J］.Journal of Food Chemistry，1999，67:1－5

［8］張琳.嗜酸乳桿菌共軛亞油酸異構(gòu)酶的純化與生物信息學(xué)分析［D］.鄭州:河南工業(yè)大學(xué)，2007

［9］張鎮(zhèn).亞油酸異構(gòu)酶基因的克隆、表達(dá)及其功能鑒定［D］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

Analysis of Expression Regulation Mechanism of Linoleic Acid Isomerase Gene of Lactobacillus acidophilus

Chen Shihua1Wu Xingquan1Zhang Hui Cao Jian2
(Henan University of Technology1，Zhengzhou 450052)
(Zhongyuan University of Technology2，Zhengzhou 450007)

The location of linoleic acid isomerase gene and it's promoter in the genome of lactobacillus acidophilus were confirmed，and it was found that the gene structure is monocistron.The linoleic acid isomerase was detected to be in a branched metabolic pathway alone without any enzyme in the upstream or downstream.Four regulation regions upstream of the linoleic acid isomerase genes of four kinds of Lactobacillus were analyzed and 12 conserved sites were found which maybe regulate the gene expression induced by linoleic acid.Results show that there is no signal peptide in the protein，but there is a transmembrane domain with orientation slightly preferred to be from outside to inside.The codon bias of Lactobacillus acidophilus was compared with that of Escherichia coli.Results reveal the difference of the codon bias between the two bacteria would affect the gene expression in Escherichia coli probably，and a plan for improvement is proposed.

lactobacillus acidophilus，linoleic acid isomerase，gene expression，mechanism

Q71 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1003－0174(2010)11－0062－04

河南省高校杰出科研人才創(chuàng)新工程項(xiàng)目(2006KYCX-008)

2009－11－02

陳士華，女，1972年出生，副教授，分子生物學(xué)與生物信息學(xué)

曹健，女，1969年出生，教授，微生物學(xué)