吳 瑕江連洲王晰銳王 鑫

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)成棟學(xué)院1,哈爾濱 150030)

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院2,哈爾濱 150030)

超聲波預(yù)處理對大豆蛋白酶水解物抗氧化活性的影響

吳 瑕1江連洲2王晰銳2王 鑫2

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)成棟學(xué)院1,哈爾濱 150030)

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院2,哈爾濱 150030)

試驗采用超聲波法對大豆蛋白溶液進行預(yù)處理,再用堿性蛋白酶進行水解,通過大豆蛋白酶水解物的亞鐵還原能力來確定超聲波預(yù)處理的最佳工藝條件。結(jié)果表明,經(jīng)超聲波預(yù)處理大豆蛋白溶液最佳工藝條件為超聲波功率:500 W,超聲波處理時間:30 min,超聲波處理溫度:70℃。經(jīng)超聲波預(yù)處理的酶水解物抗氧化能力強于未經(jīng)超聲波處理的 5 h酶水解物且差異顯著(P<0.05)。超聲波預(yù)處理的酶水解物亞鐵還原能力雖不及BHA(P<0.05),但明顯強于抗壞血酸(P<0.05)。超聲波預(yù)處理的酶水解物對 TBARS抑制效果和DPPH清除能力均強于未經(jīng)超聲波處理的 5 h酶水解物(P<0.05)。

超聲波 預(yù)處理 抗氧化活性 大豆蛋白 酶水解物

大豆蛋白酶水解物氨基酸組成與大豆蛋白基本相同,其必需氨基酸平衡良好,含量豐富,具有許多優(yōu)良的功能性質(zhì)。目前已發(fā)現(xiàn)大豆蛋白酶水解物具有抗氧化、降血壓、降膽固醇、降血糖、抗疲勞、抗癌、免疫等生理活性,其中抗氧化性是大豆肽其他生理功能的基礎(chǔ)[1]。預(yù)處理大豆蛋白的目的:一是使蛋白質(zhì)充分變性,二是使蛋白質(zhì)盡可能多的打開二硫鍵、三是除去異味。預(yù)處理常采用物理方法和化學(xué)方法。物理方法有加熱法、微波法、超聲波法等。化學(xué)方法如加酸、加堿處理或添加化學(xué)試劑,可以大大提高酶解效果。但是化學(xué)方法易引入雜質(zhì),且有可能導(dǎo)致氨基酸受到一定程度的破壞,降低產(chǎn)品的營養(yǎng)價值,影響產(chǎn)品最終品質(zhì)[2]。

本試驗采用超聲波法對大豆蛋白溶液進行預(yù)處理,再用堿性蛋白酶水解,以促進酶解進程,獲得高活性的抗氧化多肽,通過大豆蛋白水解物的還原能力來確定超聲波預(yù)處理的最佳工藝條件,同時對預(yù)處理影響酶水解物抗氧化活性的機理進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆分離蛋白:哈高科大豆食品有限責(zé)任公司;堿性蛋白酶:丹麥諾維信公司;大豆卵磷脂、抗壞血酸、丁基羥基茴香醚 (BHA)、三吡啶三吖嗪 (2,4,-Tris(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ)、二苯代苦味肼基自由基 (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DP2 PH):Sigma公司;其他試劑均為分析純。

SB25-12DTD超聲波清洗器機:寧波新芝生物科技股份有限公司;XHF-D高速分散器:寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大豆蛋白酶水解物的制備

將大豆蛋白溶解后,調(diào)節(jié)溶液 pH值、溫度至最適條件,加入堿性蛋白酶,反應(yīng)過程中不斷加入1 mol/L的NaOH,使 pH值保持恒定,記錄耗堿量(mL),用于計算水解度 (degree of hydrolysis,DH),待水解結(jié)束后沸水浴 5 min使酶滅活,水解液用來測定抗氧化能力。

1.2.2 超聲波預(yù)處理條件的確定

大豆蛋白溶液進行酶解以前,采用超聲波清洗器機對其進行震蕩處理。在超聲頻率為 20 kHz條件下,對超聲功率、超聲溫度及超聲時間進行正交優(yōu)化,以水解物的亞鐵還原能力為指標(biāo),確定最佳的超聲處理條件。

1.2.3 水解度的測定

根據(jù) pH-Stat法[3],水解度計算公式為 DH= h/htot

式中:h為單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中被水解的肽鍵的量(mmol/g);htot為每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵的物質(zhì)的量/mmol/g,對大豆分離蛋白,該值取 7.8。

1.2.4 亞鐵還原能力的測定

參照 Benzie等[4]的方法。取 3.0 mL新配的FRAP(亞鐵還原能力,Ferric Reducing Ability of Pow2 er)試劑(由 pH值為 3.6,濃度為 300 mmol/L醋酸鹽緩沖液 25 mL,10 mmol/L的 TPTZ溶液2.5 mL和 20 mmol/L的 FeCl3·6H2O溶液 2.5 mL混合在一起組成)加熱到 37℃,向其中加入 0.1 mL大豆蛋白水解物,0.3 mL的 H2O,室溫反應(yīng) 10 min,在 593 nm讀取吸光度值。以 100～1000μmol/L的 FeSO4·7H2O制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品抗氧化活性以達到同樣吸光度所需的 FeSO4·7H2O物質(zhì)的量表示。同時以未水解的大豆蛋白進行試驗,采用BHA和抗壞血酸作為陽性對照。

1.2.5 脂肪氧化體系的制備

卵磷脂脂質(zhì)體氧化體系 (soybean phosphatidylcholine liposome),采用 Decker等[5]的方法并進行一些改進。將大豆卵磷脂 (0.2 g/L)溶解在濃度為0.12mol/L的 KCl,5 mmol/L組氨酸緩沖溶液(pH值為 6.8)均質(zhì)后,在 4℃進行超聲波處理 45 min[6]。對照用 1 mL水代替 1 mL樣品溶液與 5 mL的脂質(zhì)體溶液混合,同時以未水解的大豆蛋白進行試驗,以未水解蛋白作為陰性對照,以BHA和抗壞血酸作為陽性對照。脂質(zhì)氧化由鐵的氧化還原反應(yīng)引發(fā),將0.1 mL濃度為 50 mmol/L的 FeCl3和 0.1 mL濃度為10 mmol/L抗壞血酸鹽加入脂質(zhì)體氧化體系中。樣品在 37℃水浴中保溫 1 h,并迅速測定硫代巴比妥酸反應(yīng)物 (Thiobarbituric acid-reactive substances, TBARS)值。

1.2.6 硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)(TBARS)的測定

參照 Sinnhuber等[7]的方法,并作適當(dāng)?shù)男薷?。? mL樣品加入 3 mL硫代巴比妥酸溶液、17 mL三氯乙酸 -鹽酸溶液,混勻后,沸水浴中反應(yīng) 30 min,冷卻,取 5 mL樣品加入等體積的氯仿,3 000 r/min下離心10 min,532 nm下讀取吸光值。TBARS值以每升脂質(zhì)氧化樣品溶液中丙二醛的毫克數(shù)表示。

TBARS=(A532/Vs)×9.48

式中:A532nm為溶液的吸光值;Vs為樣品的體積; 9.48為常量,與硫代巴比妥酸反應(yīng)物的稀釋倍數(shù)和摩爾消光系數(shù)有關(guān)。

1.2.7 對DPPH穩(wěn)定自由基的清除

參照 Yen等[8]的方法。在反應(yīng)管中加入1.0 mL濃度為 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液,再加入4 mL的不同濃度的大豆蛋白水解液,混合均勻,黑暗下室溫避光反應(yīng) 30 min后在 517 nm處讀取吸光度值,同時以未水解蛋白作為陰性對照,以BHA和抗壞血酸作為陽性對照。

清除率 =[1-(A1-A2)/A3]×100%

式中:A1為 4 mL水解液 +1 mL DPPH溶液反應(yīng)后的吸光度;A2為 4 mL水解液 +1 mL乙醇的吸光度;A3為 4 mL乙醇 +1 mL DPPH溶液的吸光度。

1.2.8 統(tǒng)計分析

每個試驗重復(fù) 3次,結(jié)果表示為平均數(shù) ±SD。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用 SPSS軟件進行,差異顯著性(P< 0.05)分析使用 Turkey HSD程序,采用 Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波預(yù)處理條件的優(yōu)化

通過三因素三水平 L9(33)正交試驗來完成,各因素和水平如下:

表 1 超聲處理條件正交試驗表L9(33)

以表 1中的因素水平條件進行預(yù)處理,對預(yù)處理后的大豆蛋白溶液再進行水解,試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 超聲波預(yù)處理正交試驗設(shè)計與結(jié)果

經(jīng)極差分析得到各因素的主次順序為功率 >時間 >溫度。最優(yōu)條件為超聲波功率:500 W,超聲波處理時間:30 min,超聲波處理溫度:70℃。

2.2 驗證試驗

采用最佳超聲波預(yù)處理條件即超聲波功率 500 W,超聲波處理時間 30 min,超聲波處理溫度 70℃對大豆蛋白溶液進行預(yù)處理,然后進行堿性蛋白酶水解,測定水解液的亞鐵還原能力,抑制卵磷脂脂質(zhì)體氧化體系的能力,DPPH自由基清除能力。

2.2.1 超聲波處理對水解度的影響

在底物質(zhì)量濃度 50 mg/mL、加酶量 2%(E/S)、酶解溫度 60℃、pH 8.0條件下,堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白,不同時間水解度見圖 1,5 h水解物的水解度為 18.56%。經(jīng)超聲波處理的大豆蛋白溶液在相同條件下酶解,其水解度呈增加趨勢,5 h水解物的水解度為 19.12%,與未經(jīng)超聲波處理相比差異不大。

圖1 不同水解時間的水解度

2.2.2 超聲波預(yù)處理對抗氧化活性的影響

經(jīng)最佳超聲波預(yù)處理工藝處理后得到的大豆蛋白酶水解物的亞鐵還原能力、卵磷脂脂質(zhì)體氧化體系抑制能力、DPPH自由基清除能力結(jié)果見圖 2至圖4。

圖 2說明,隨著時間的延長,經(jīng)最佳超聲波預(yù)處理工藝處理后得到的大豆蛋白酶水解物的還原能力強于未經(jīng)超聲波水解的。未經(jīng)預(yù)處理的大豆蛋白酶水解物從 1 h到 5 h,還原能力從 662.13μmo/L增加到 823.38μmo/L;超聲波預(yù)處理以后,水解物的還原能力從 928.38μmo/L增加到 1 062.13μmo/L,比未經(jīng)預(yù)處理時分別提高 1.4倍和 1.3倍。

由圖 3可以得出,大豆蛋白水解物 TBARS值隨水解時間的延長呈下降趨勢,即水解液對卵磷脂脂質(zhì)氧化體系的抑制作用呈增強趨勢。未經(jīng)超聲波預(yù)處理時,水解時間從 1 h到 5 h時,TBARS值由 3.74 mg/L降低到 2.74 mg/L;超聲波預(yù)處理以后,TBARS值為由 3.69 mg/L降低到 2.69 mg/L,比未經(jīng)預(yù)處理時分別降低 0.98倍。

由圖 4可見,隨著時間的增加,變化呈升高趨勢。未經(jīng)超聲波預(yù)處理的 1 h水解物 DPPH自由基清除率為 48.47%,5 h水解物清除率達到 68.47%;經(jīng)超聲波預(yù)處理后 1 h水解物DPPH自由基清除率為 49.49%,5 h水解物清除率為 71.86%,比未經(jīng)超聲波處理時分別提高 1.02倍和 1.04倍。

綜合比較經(jīng)超聲波預(yù)處理和未經(jīng)預(yù)處理的水解物的亞鐵還原能力,對卵磷脂脂質(zhì)氧化體系的抑制作用和DPPH自由基清除能力可知,經(jīng)超聲波預(yù)處理后的大豆蛋白酶水解物抗氧化性得到提高。

2.2.3 超聲波處理后水解物與常用抗氧化劑抗氧化活性比較

試驗過程中,以未水解大豆蛋白作為陰性對照,以BHA和抗壞血酸作為陽性對照,得到大豆蛋白酶水解物與常用抗氧化劑抗氧化活性見表 3。

表 3 大豆蛋白水解物與常用抗氧化劑抗氧化活性的比較

由表 3可以看出,經(jīng)超聲波預(yù)處理的酶水解物抗氧化能力強于未經(jīng)超聲波處理的 5 h酶水解物且差異顯著(P<0.05)。超聲波預(yù)處理的酶水解物亞鐵還原能力雖不及BHA(P<0.05),但明顯強于抗壞血酸(P <0.05)。超聲波預(yù)處理的酶水解物對 TBARS抑制效果和DPPH清除能力均強于未經(jīng)超聲波處理的 5 h酶水解物(P<0.05),與未水解的大豆蛋白和空白相比,其抗氧化效果有明顯優(yōu)勢(P<0.05)。一定的功率下,超聲波預(yù)處理底物,雖未導(dǎo)致水解度大幅度提高,由于引起大豆蛋白一些基團暴露,使構(gòu)象發(fā)生變化,大豆蛋白酶水解物的抗氧化活性提高。也可能是因為超聲波預(yù)處理使大豆蛋白內(nèi)部抗氧化性氨基酸如組氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸等充分暴露出來,這些氨基酸對抗氧化肽活性和穩(wěn)定性的提高具有重要的作用[7-9]。賈俊強等[10]從超聲預(yù)處理的大米蛋白中制備抗氧化肽時,酶的使用量較未經(jīng)超聲波處理時用量低,并提出超聲預(yù)處理不僅提高抗氧化肽的活性,也提高了抗氧化肽得率,提高了酶的使用效率。目前,“酶解 -膜分離耦合”技術(shù)已被廣泛用于活性肽的制備[11],超聲波預(yù)處理技術(shù)若與其結(jié)合使用可極大地降低酶使用量,提高酶解產(chǎn)量,這也是今后研究的重點。

3 結(jié)論

采用超聲波法對大豆蛋白溶液進行預(yù)處理,再用堿性蛋白酶水解,以大豆蛋白水解物的還原能力來確定超聲波預(yù)處理的最佳工藝條件為超聲波功率:500 W,超聲波處理時間:30 min,超聲波處理溫度:70℃。經(jīng)此預(yù)處理條件得到的大豆蛋白酶水解物抗氧化活性比未經(jīng)超聲波預(yù)處理的酶水解物抗氧化活性強。經(jīng)預(yù)處理后 5 h酶水解物亞鐵還原能力為:1 062.13μmol/L,在脂質(zhì)氧化體系中對 TBARS的抑制作用為 2.64 mg/L,DPPH自由基清除率為71.86%,水解度為 19.12%。

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Antioxidant Effect of Soybean Isolate Protein Enzymatic Hydrolysate Treated byUltrasonic

Wu Xia1Jiang Lianzhou2Wang Xirui2Wang Xin2
(Chengdong college,NortheastAgriculture University1,Harbin 150030)
(Food College,NortheastAgriculture University2,Harbin 150030)

Soybean protein was pretreated by ultrasonic first,then was hydrolysed by alcalase.The optimal con2 ditions of the ultrasonic treatmentwere obtained according to FRAP values.Results:The opti mal ultrasonic treatment conditions are ultrasonic power 500 W,treating for 30 min at 70℃.The antioxidant effect of the enzymatic hydroly2 sate after the ultrasonic pretreat ment is significantly enhanced.The FRAP value of the enzymatic hydrolysate after the ultrasonic pretreatment is stronger than ascorbic acid(P<0.05)whereas weaker than that of BHA(P<0.05).The TBARS value and scavenging rate forDPPH free radicalsof the enzymatic hydrolysate after ultrasonic pretreatment are all greater than those of the untreated(P<0.05).

ultrasonic,pretreatment,antioxidant effect,soybean protein,enzymatic hydrolysate

TS214.2 文獻標(biāo)識碼:A 文章編號:1003-0174(2010)10-0032-05

863計劃(2006AA10Z322)

2009-10-20

吳瑕,女,1978年出生,講師,博士,糧食、油脂及植物蛋白工程

江連洲,男,1960年出生,教授,博士生導(dǎo)師,糧食、油脂及植物蛋白工程