王俊平，張偉偉，杜欣軍，吳懿娜，董 峰，王 碩

（食品營(yíng)養(yǎng)與安全省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

西維因單鏈抗體基因克隆、表達(dá)及活性分析

王俊平，張偉偉，杜欣軍，吳懿娜，董 峰，王 碩*

（食品營(yíng)養(yǎng)與安全省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

利用兼并引物從西維因單克隆雜交瘤細(xì)胞的cDNA中克隆得到抗體基因的輕鏈可變區(qū)（VL）和重鏈可變區(qū)（VH），長(zhǎng)度分別為324bp和360bp，將其分別連接入pGEM-T-Easy載體進(jìn)行測(cè)序；根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物和連接序列（Gly4Ser）3，利用重疊延伸PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為729bp的單鏈抗體基因片段（scFv），亞克隆至原核表達(dá)載體pET30a（+），并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)果顯示，重組表達(dá)單鏈抗體形成包涵體，分子量大小約為33kDa，變性后利用不同條件進(jìn)行復(fù)性，結(jié)果顯示最佳復(fù)性時(shí)間為48h，最佳起始蛋白濃度為200μg/mL，含有精氨酸的復(fù)性液效果最佳；利用親和層析純化scFv，并利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)其活性，結(jié)果顯示該scFv對(duì)西維因具有良好的親和性和特異性。

西維因，單鏈抗體，克隆，表達(dá)，活性

西維因（Carbaryl）是氨基甲酸酯類農(nóng)藥的一種，廣泛用于防治稻、麥、棉、果樹(shù)、蔬菜等作物害蟲(chóng)，畜禽外寄生蟲(chóng)和衛(wèi)生害蟲(chóng)。它是一種接觸性殺蟲(chóng)劑，兼有內(nèi)吸活性，如殘留在體內(nèi)，能抑制膽堿酯酶，使乙酰膽堿在組織中蓄積，進(jìn)而導(dǎo)致流涎、惡心、流淚、瞳孔縮小、視力模糊、痙攣等，甚至造成致畸、慢性神經(jīng)中毒等嚴(yán)重危害，其在作物和蔬菜上的農(nóng)藥殘留會(huì)對(duì)人體健康造成較大的危害［1-2］。目前用于檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法很多，而酶聯(lián)免疫技術(shù)以其靈敏度高，適合于檢測(cè)大量樣品以及成本低、無(wú)需大型昂貴儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到歡迎［3］。為了建立西維因的酶聯(lián)免疫分析方法，首先必須制備特異性好的抗體。而單鏈抗體是用基因工程方法將抗體的輕鏈可變區(qū)（VL）和重鏈可變區(qū)（VH）通過(guò)一段連接肽（linker）連接而成的重組蛋白，是保持了親本抗體全部特異性和結(jié)合能力并具有最小的結(jié)構(gòu)單位的小分子。scFv具有能在細(xì)菌中表達(dá)，易于基因操作和大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，這對(duì)于西維因大規(guī)模檢測(cè)及檢測(cè)產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化具有重要意義［4-5］。本實(shí)驗(yàn)從能分泌特異性西維因單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞中分離純化西維因單鏈抗體的基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)，通過(guò)透析復(fù)性的方法獲得具有抗原結(jié)合活性的單鏈抗體。

表1 scFv克隆所用引物

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西維因雜交瘤細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)室制備；總RNA提取試劑 上海博星基因芯片有限責(zé)任公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 Fermentas公司；Pfu DNA聚合酶、pET30a（+）質(zhì)粒載體、大腸桿菌BL21（DE3） Promega公司；His-Bind樹(shù)脂 Novagen公司；西維因酶標(biāo)抗原本實(shí)驗(yàn)室合成；PCR引物 上海生物工程公司合成。

PCR儀、SDS-GAGE系統(tǒng)、冷凍離心機(jī) Bio-Rad公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 VL、VH克隆及測(cè)序鑒定 從1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用兼并引物分別擴(kuò)增 VL和VH［6］，PCR反應(yīng)條件為：94℃，5min；94℃，1min；53℃，1min；72℃，1min，循環(huán)35次；72℃，10min。電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，膠回收PCR產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物連接到pGEM-T-Easy載體，經(jīng)酶切鑒定與PCR鑒定后進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析鑒定。1.2.2 scFv基因片段克隆 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，重新設(shè)計(jì)引物VLF和VLR，VHF和VHR（表1），分別從VL-pGEM-T-Easy質(zhì)粒和VH-pGEM-T-Easy質(zhì)粒擴(kuò)增VL和VH片段，之后通過(guò)兩步法將VL，VH進(jìn)行重疊延伸獲得scFv基因片段；將膠回收的VL和VH等量混合后加入50μL的PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行無(wú)引物延伸反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃，1min；58℃，1min；72℃，1min，反應(yīng)進(jìn)行10個(gè)循環(huán)；反應(yīng)后，向反應(yīng)體系中加入引物VHF、VLR及Pfu DNA聚合酶進(jìn)行第2步反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃，1min；63℃，1min；68℃，1min，循環(huán)20次。電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3 重組表達(dá)載體構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá) 用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切膠回收的scFv，之后將其連接到同樣雙酶切的pET30a（+）質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）。挑取抗性生長(zhǎng)克隆增菌培養(yǎng)，并用0.1mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），37℃，200r/min誘導(dǎo)5h。收集菌液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.4 包涵體復(fù)性的條件優(yōu)化

1.2.4.1 包涵體的分離與變性 根據(jù)SDS-PAGE檢測(cè)鑒定結(jié)果，取陽(yáng)性克隆IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集細(xì)菌。用超聲方法破碎細(xì)胞。10000×g，4℃離心20min收集沉淀。沉淀用包涵體洗滌液A（50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，pH=8.0）洗滌2次，用包涵體洗滌液B（50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，8mol/L脲，pH=8.0）洗滌2次，加入包涵體變性緩沖液（0.1mol/L Tris-HCl，10mmol/L DTT，8mol/L脲，pH =8.0），37℃，200r/min，快速振蕩1h。10000×g，4℃離心20min，收集上清［7］。

1.2.4.2 最佳復(fù)性條件的確定 用變性液將變性蛋白濃度稀釋至200μg/mL，于50倍體積的復(fù)性液Ⅰ（0.1mol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，pH=8.0）中4℃分別透析 12、24、36、48h，每 12h更換一次透析液。

用變性液將變性蛋白分別稀釋至500、200、100、50μg/mL，于50倍體積的復(fù)性液Ⅰ（0.1mol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，pH=8.0）中4℃分別透析48h。

分別在復(fù)性液Ⅰ中加入5mmol/L還原型谷胱甘肽（GSH）和0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽（GSSG），5%甘油，0.4mol/L L-精氨酸（L-Arg），分別進(jìn)行透析復(fù)性。

以上各方法透析產(chǎn)物經(jīng)4℃，10000×g離心20min。Bradford法測(cè)抗體濃度，計(jì)算復(fù)性率。復(fù)性率計(jì)算公式：蛋白復(fù)性率（%）=復(fù)性后樣品量/復(fù)性起始樣品量×100%，最后采用最優(yōu)條件進(jìn)行透析復(fù)性。

1.2.5 scFv純化與活性鑒定 按照試劑說(shuō)明書(shū)步驟，過(guò)His-Bind親和層析柱純化復(fù)性蛋白，Bradford法測(cè)抗體濃度，SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。

用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法分析純化抗體的活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 VL和VH基因擴(kuò)增及測(cè)序

從西維因雜交瘤細(xì)胞中，利用小鼠抗體基因簡(jiǎn)并引物，分別PCR擴(kuò)增單克隆抗體可變區(qū)VL和VH基因。將擴(kuò)增得到的單鏈抗體基因進(jìn)行序列測(cè)定，并對(duì)輕鏈和重鏈測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明克隆序列為小鼠抗體可變區(qū)基因片段，片段長(zhǎng)度分別為324bp和360bp（圖1）。

圖1 VL、VH基因片段擴(kuò)增M：DNA Marker；1：VH；2：VL。

2.2 scFv基因克隆

根據(jù)輕重鏈可變區(qū)測(cè)序結(jié)果重新設(shè)計(jì)輕、重鏈引物，運(yùn)用重疊延伸法將輕、重鏈可變區(qū)連接形成scFv，片段大小為729bp（圖2），核苷酸及氨基酸序列如圖3所示。

圖2 scFv PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 西維因單鏈抗體scFv基因片段序列

2.3 重組表達(dá)

將單鏈抗體進(jìn)行雙酶切，與同樣雙酶切的pET30a（+）連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和酶切驗(yàn)證（圖4）。

圖4 重組表達(dá)質(zhì)粒scFv-pET30a（+）鑒定

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3），挑取單菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE顯示目的蛋白存在于菌體破碎后的沉淀中，即形成了包涵體，分子量大小約為33kDa（圖5）。

2.4 復(fù)性條件優(yōu)化

2.4.1 復(fù)性時(shí)間的優(yōu)化 分別測(cè)定不同復(fù)性時(shí)間下2：菌體破碎后的上清液；3：IPTG誘導(dǎo)后菌體；4：未誘導(dǎo)菌體。的蛋白復(fù)性率，可知在48h以上復(fù)性率差異不大（圖6），由此確定最佳復(fù)性時(shí)間為48h。

圖5 scFv在BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)

圖6 復(fù)性時(shí)間的優(yōu)化

2.4.2 復(fù)性蛋白起始濃度的優(yōu)化 分別測(cè)定不同起始濃度的復(fù)性率，可知復(fù)性率隨起始蛋白濃度升高而降低，但由于總體復(fù)性量在200μg/mL時(shí)最高（圖7），所以選擇此起始蛋白濃度為最適蛋白起始濃度。

圖7 復(fù)性起始濃度的優(yōu)化

2.4.3 復(fù)性液組成成分進(jìn)行的優(yōu)化 分別測(cè)定復(fù)性率，可知L-Arg的添加對(duì)復(fù)性率有很大提高（圖8），由此確定復(fù)性液成分為0.1mol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，0.4mol/L L-Arg，pH=8.0。

圖8 復(fù)性液成分優(yōu)化

2.5 scFv活性鑒定

2.5.1 復(fù)性抗體的親和純化 將包涵體進(jìn)行破碎，洗滌，變性，在最優(yōu)條件下（起始蛋白濃度為200μg/mL；復(fù)性液為0.1mol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，0.4mol/L L-Arg，pH=8.0；4℃復(fù)性48h）進(jìn)行透析復(fù)性后，用Bradford法測(cè)抗體濃度約為40μg/mL菌液。再經(jīng) His-Bind樹(shù)脂柱純化復(fù)性的 scFv，SDS-PAGE顯示純化效果較好（圖9）。

圖9 scFv過(guò)His-Bind柱純化效果

2.5.2 直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 在聚苯乙烯酶標(biāo)板上包被純化抗體（1μg/well），室溫下孵育過(guò)夜，洗滌后，加入不同稀釋度西維因標(biāo)樣和相同稀釋度酶標(biāo)抗原（各100μg/well），室溫下反應(yīng)1h，洗滌后，添加150μL底物液，室溫下顯色20min，再添加50μL終止液，終止反應(yīng)。在雙波長(zhǎng)方式（450/650nm）下用酶標(biāo)儀讀取OD值（圖10）。

圖10 西維因直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA鑒定結(jié)果

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，吸光值隨標(biāo)品加入量的增加而降低，純化后的scFv蛋白可以與其相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合。

3 討論

包涵體復(fù)性的方法很多，目前常用的復(fù)性方法主要有稀釋復(fù)性、透析復(fù)性和層析復(fù)性，而其中透析復(fù)性是實(shí)驗(yàn)室最常用的復(fù)性方法。由于影響蛋白復(fù)性的因素很多，如氧化還原體系、表達(dá)蛋白的濃度、復(fù)性的時(shí)間以及復(fù)性的溫度等，不同的蛋白其復(fù)性條件需要具體摸索。本實(shí)驗(yàn)采用透析復(fù)性方法，將復(fù)性蛋白濃度調(diào)至200μg/mL，有效避免了鏈間二硫鍵的產(chǎn)生，同時(shí)在復(fù)性緩沖液中加入L-Arg，可非特異性結(jié)合于錯(cuò)配二硫鍵和不正確折疊結(jié)構(gòu)，降低其穩(wěn)定性，并使之逐漸轉(zhuǎn)變成正確折疊。實(shí)驗(yàn)對(duì)scFvpET30a（+）蛋白復(fù)性條件的確定只是初步的，對(duì)于如何大量獲得高純度有活性的目的蛋白，還有待于進(jìn)一步摸索更為有效的復(fù)性方法［8-10］。

由于單鏈抗體是單價(jià)抗體，只有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，其穩(wěn)定性和親和力都較天然抗體低，并且只能與一種抗原特異性結(jié)合，功能單一，為此可將單鏈抗體進(jìn)行進(jìn)一步改造，以提高其活性和功能。例如將scFv中二個(gè)可變區(qū)之間的接頭縮短，迫使二個(gè)分子間的VL和VH配對(duì)形成雙價(jià)抗體，其結(jié)合性能優(yōu)于單價(jià)分子。如果將兩種不同特異性的可變區(qū)基因交叉配對(duì)，則可得到雙特異抗體［11-13］。

［1］張一賓，張懌，等.農(nóng)藥［M］.北京：中國(guó)物質(zhì)出版社，1997：1-6.

［2］Kuhr R J，Dorough W.Carbamate Tnsecticides：Chemistry，Biochemistry and Toxicology［J］.USA：CRC Press，Inc，1976：135-140.

［3］Manclus J J，Primo J，Montoya A.Development of enzymelinked immunosorbent assays for the insecticide chlorpyrifos 1. Monoclonal antibody production and immunoassay design［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996，44（12）：4052-4062.

［4］苗向陽(yáng)，郝慧芳，丁淑燕，等.抗豬脂肪細(xì)胞膜單鏈抗體基因的構(gòu)建及鑒定［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，35（2），121-124.

［5］Baneyx F.Recombinant protein expression in Escherichia coli［J］.Current Opinion in Biotechnology，1999，10（5）：411-421.

［6］Imai S，Mukai Y，Nagano K，et al.Quality enhancement of the non-immune phage scFv library to isolate effective antibodies［J］.Biological and Pharmaceutical Bulletin，2006，29（7）：1325-1330.

［7］Kuhelj R，Dolinar M，Pungercar J，et al.The preparation of catalyticallyactive human cathepsin B from its precursor expressed in Escherichia coli in the form of inclusion bodies［J］. Eur J Biochem，1995，229（2）：533-539.

［8］羅惠霞，李敏，王玉炯.包涵體蛋白復(fù)性的幾種方法［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2007（5）：96-98.

［9］于德強(qiáng)，何詢.重組蛋白復(fù)性技術(shù)研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通訊，2004，15（1）：67-69.

［10］夏啟玉，肖蘇生，鄧柳紅，等.包涵體蛋白的復(fù)性研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（14）：5801-5803.

［11］Paul S，Nishiyama Y，Planque S，et al.Theory of proteolytic antibody occurrence［J］.Immunol Lett，2006，103（1）：8-16.

［12］Holliger P，Prospero T，Winter G.“Diabodies”：small bivalent and bispecific antibody fragment［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1993，90（14）：6444-6448.

［13］Mack M，Riethmuller G，Kufer P.A small bispecific antibody construct expressed as a functional single-chain molecule with high tumor-cell cytotoxicity［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1995，92（15）：7021-7025.

Cloning，expression and activity analysis of single chain variable fragment（scFv）against carbaryl

WANG Jun-ping，ZHANG Wei-wei，DU Xin-jun，WU Yi-na，DONG Feng，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Variable regions of ligh（t324bp）chains（VL）and heavy（360bp）chains（VH）of antibody genes were cloned from hybridoma that secreting specific antibody against carbaryl using generate primers.The VLand VHwere cloned into pGEM-T-Easy and sequenced.Specific primers synthesized based on the sequenced fragments were used to amplify single chain variable fragment（scFv）which was composed of 729bp.The scFv was subcloned into pET30a（+）and transformed into E.coli BL21（DE3）for recombinant expression.Polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）results indicated that the recombinant expressed scFv formed inclusion bodies and the molecular weight was about 33kDa.Different renaturation conditions were selected to obtain more soluble proteins and the results demonstrated that 48h，200μg/mL initiative protein concentration and renaturation reagent containing arginine were the optimal conditions for renaturation.His-Bind resin was used to purify scFv.The purified recombinant antibodies presented good affinity and specificity base on competitive ELlSA.

carbaryl；scFv；cloning；expression；activity

Q789

A

1002-0306（2010）11-0161-04

2009-11-04 *通訊聯(lián)系人

王俊平（1969-），男，副教授，博士，研究方向：食品安全管理與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2006AA10Z448）；國(guó)家自然科學(xué)基金（20905058）。