吳彬彬，郭本恒，，*，張 灝，王蔭榆，吳正鈞

（1.江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214036；2.光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心，上海200436）

一株具有抑制麥芽糖酶活性的乳酸菌的篩選與鑒定

吳彬彬1，郭本恒1，2，*，張 灝1，王蔭榆2，吳正鈞2

（1.江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214036；2.光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心，上海200436）

以抑制麥芽糖酶為目的，采用α-葡萄糖苷酶抑制劑的體外篩選模型，篩選出具有較好麥芽糖酶抑制效果的乳酸菌菌株JH28。菌株JH28的MRS發(fā)酵上清及無細胞提取物均對麥芽糖酶有抑制作用。將該菌株的無細胞提取物經(jīng)透析膜（截留分子量1000Da，去離子水為透析液）透析后取透析液凍干，測定不同濃度凍干物對麥芽糖酶的抑制效果，最高抑制率可達67.19%，經(jīng)計算其IC50為4.12mg/mL。菌株經(jīng)16S rDNA鑒定為干酪乳桿菌，具有潛在的工業(yè)應用價值。

乳酸菌，篩選，抑制，麥芽糖酶

根據(jù)1999年世界衛(wèi)生組織（WHO）和國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）公布的定義，糖尿?。―M，DiabetesMellitus）一詞是描述一種多病因的代謝疾病，特點是慢性高血糖，伴隨因胰島素（Insulin）分泌及/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。由糖尿病引起的高血糖癥將會導致各種血管綜合病癥發(fā)病率的增加，如視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變及腎臟病變［1］。因此，控制餐后高血糖對于治療早期糖尿病及減輕慢性血管綜合癥具有極其重要的意義［2］。其中，控制進食后碳水化合物的吸收是一種降低餐后高血糖的治療方法。由于小腸只能夠吸收和運輸單糖到血液循環(huán)中，而α-葡萄糖苷酶能夠?qū)⒍嗵撬鉃閱翁?，因此被認為是腸內(nèi)葡萄糖吸收的重要因素。麥芽糖酶是位于小腸內(nèi)的一種重要的α-葡萄糖苷酶，能夠?qū)⒁环肿欲溠刻撬鉃閮煞肿悠咸烟牵侨梭w消化吸收葡萄糖，轉(zhuǎn)化為血糖的重要因素。對于II型-非胰島素依賴型糖尿（NIDDM）病患者而言，服用一些含有α-葡萄糖苷酶抑制劑的降血糖口服藥能夠有效地降低高血糖［3］。這些藥物能夠抑制雙糖水解成單糖，減緩葡萄糖的消化與吸收，從而降低餐后血液中的血糖含量。自從1960年，nojirimycin被發(fā)現(xiàn)以來，人們又從天然產(chǎn)物中分離或人工合成了大量的葡萄糖苷酶抑制劑。Young-Jun Shim［4］等研究了草本植物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，提出它可能會通過抑制碳水化合物的消化和吸收從而影響葡萄糖的攝入，維持糖尿病人正常的葡萄糖動態(tài)平衡。近年來，有報道稱益生菌（乳酸菌）對于糖尿病的治療有一定效果［5］，S.l.Yun［6］等從母乳中篩選出BNR17，以活菌喂養(yǎng)進行動物實驗，研究發(fā)現(xiàn)BNR17能夠有效降低血糖及改善糖尿病癥狀。然而，盡管有諸多研究表明乳酸菌具有減少糖尿病發(fā)病率的潛力，人們對于乳酸菌作為糖尿病治療劑的研究還是很少。本文以麥芽糖酶為靶向酶，建立了α-葡萄糖苷酶抑制劑的體外篩選模型，篩選具有抑制麥芽糖酶活性的乳酸菌。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

菌株 來源于健康人體糞便及光明乳業(yè)技術(shù)中心保藏的菌種（包括干酪乳桿菌LC2W，BD-2，植物乳桿菌ST-III，鼠李糖乳桿菌LGG等）；麥芽糖酶（maltase，EC3.2.1.20）、p-Nitrophenyl- α -glucopyranoside（PNP-glycoside） sigma公司；其他試劑 國產(chǎn)常規(guī)生化純和分析純試劑；MRS培養(yǎng)基德國Merck公司。

恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；KAT 25高速組織分散機 德國IKA公司；Avanti J30I高速冷凍離心機 Beckman Coulter公司；厭氧培養(yǎng)箱英國 RUSKINN TECHNOLOGY LIMITED公司；APV1000型高壓均質(zhì)機 丹麥APV公司；PHS-25型pH計 奧立龍公司；真空冷凍干燥機、TH-CB-402型超凈工作臺 LABCONCO公司；CE7250型紫外分光光度計 BIO-AQUARIUS公司；；MDF-U超低溫冰箱日本SANYO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離和保存 從健康人體糞便中取樣，采用pH6.8的無菌緩沖液進行10倍梯度稀釋，取10-3、10-4、10-5、10-6四個稀釋度涂布于乳酸菌分離培養(yǎng)基平板上，37℃厭氧培養(yǎng)36～72h后，挑選單菌落，劃線純化得到純培養(yǎng)物，進行革蘭氏染色，接觸酶實驗。純化菌株在MRS斜面上4℃短期保存，置于30%（W/W）無菌甘油中，在-70℃超低溫冰箱中長期保存［7］。

1.2.2 初篩樣品的制備 實驗菌株經(jīng)活化三代后，以1%接種量轉(zhuǎn)接于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24h，4℃，8000r/min離心15min，分別收集發(fā)酵上清液及菌體。發(fā)酵上清液采用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.8，4℃保存；菌體經(jīng)磷酸鹽緩沖液（20mmol/L，pH6.8）洗滌三次，重懸于緩沖液中，高壓均質(zhì)（25，000psi）破碎細胞后，4℃，12000r/min離心15min，收集上清液，即為無細胞提取物，4℃保存。

1.2.3 復篩樣品的制備 制備方法采用L.ramchandran［8］等的方法，略加改動。

實驗菌株經(jīng)活化三代后，以1%接種量轉(zhuǎn)接于12%滅菌脫脂乳中，分別于37℃厭氧培養(yǎng)0、24、48h。取5mL發(fā)酵混合液，加入1mL去離子水，10mL 0.75N三氯乙酸（TCA），在4℃下，4000×g離心30min。取上清液經(jīng)0.45μm膜過濾，即為待測樣品，于-20℃保存。

1.2.4 麥芽糖酶抑制活性的測定 麥芽糖酶抑制活性的測定方法采用Zhang［9］等的方法，略加改動。在300μL pH6.8的緩沖中加入150μL 20mmol/L PNP-glucosidase溶液及50μL待測樣品，將混合物于37℃水浴10min。加入100μL麥芽糖酶溶液（0.2u/mL）繼續(xù)反應5min。加入2mL 0.05mol/L氨水作為反應

其中a為含有麥芽糖溶液但不含樣品的測定吸光值，b為不含麥芽糖溶液及待測樣品的測定吸光值，c為含有麥芽糖酶溶液及待測樣品的測定吸光值，d為不含麥芽糖溶液但含待測樣品的測定吸光值。

1.2.5 篩選菌種的分子生物學鑒定 菌株JH28的16S rRNA基因序列分析：PCR擴增反應采用25μL體系，反應條件：94℃，5min；94℃，1min，50～55℃，1min，72℃，1.5min，30個循環(huán)；72℃，5min?；厥誔CR產(chǎn)物，由invitrogen公司測序。終止液。并將反應液于405nm處測其吸光值，吸光值與p-nitrophenol的游離量成正比。采用以下公式計算樣品的抑制活性：

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌的初步分離

從健康人體糞便中，利用MRS固體培養(yǎng)基分離得到了200個分離株，經(jīng)過菌落形態(tài)、革蘭氏染色、接觸酶實驗排除了5株革蘭氏陰性細菌，2株接觸酶陽性細菌和2株酵母，得到191株乳酸菌分離株。

2.2 抑制麥芽糖酶活性的乳酸菌篩選結(jié)果

實驗菌株經(jīng)活化三代后，以1%接種量轉(zhuǎn)接于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24h，離心后分別取上清及菌體破碎物測其對麥芽糖酶的抑制活性，菌體破碎物測定篩選部分結(jié)果如圖1所示。取菌體破碎物抑制效果較好的菌株進行復篩，最終獲得一株JH28，其MRS發(fā)酵上清液及胞內(nèi)產(chǎn)物均對麥芽糖酶有顯著抑制效果，其胞內(nèi)產(chǎn)物在一定范圍內(nèi)對麥芽糖酶的抑制率與樣品劑量呈正相關(guān)（圖2）。

圖1 菌體篩選結(jié)果

圖2 JH28胞內(nèi)提取物對麥芽糖酶抑制作用的劑量效應

分離得到的191株乳酸菌中大部分菌株表現(xiàn)出對麥芽糖酶的促進作用，或?qū)γ富顭o影響，只有少量菌株的MRS發(fā)酵上清及胞內(nèi)產(chǎn)物對麥芽糖酶表現(xiàn)出抑制作用，將經(jīng)過初篩呈現(xiàn)陽性結(jié)果的菌株于脫脂乳中發(fā)酵24h，離心后取上清，加入TCA去除蛋白，離心后上清經(jīng)0.45μm膜過濾，所得樣品用于測其對麥芽糖酶的抑制活性。其中菌株JH28無論是MRS發(fā)酵上清還是其菌體破碎后的胞內(nèi)產(chǎn)物都對麥芽糖酶表現(xiàn)出穩(wěn)定的抑制作用，并且能于脫脂乳中發(fā)酵凝乳，脫脂乳發(fā)酵上清也有很好的抑酶活性，因此，選定菌株JH28作為實驗菌株，進行下一步實驗。

將菌株JH28經(jīng)MRS發(fā)酵后的無細胞提取物于1000Da透析膜中透析48h，將透析液冷凍干燥，所得產(chǎn)物以pH6.8緩沖液配成不同濃度溶液，分別測其對麥芽糖酶的抑制效果，并計算出IC50，為4.12mg/mL（圖2）。從圖中可以看出，當樣品濃度在1.5mg/mL以下時，隨著濃度的增加，樣品對麥芽糖酶的抑制率增加緩慢，曲線平穩(wěn)，濃度達到2.5mg/mL時，隨著樣品濃度的增加，樣品對麥芽糖酶的抑制率急劇上升，最高抑制率可達67.19%，此時樣品濃度為6mg/mL，之后隨著樣品濃度的增加，樣品對麥芽糖酶的抑制率不再升高，并隱約出現(xiàn)下降趨勢，可能是由于樣品與酶或底物的結(jié)合已達最大極限，隨后再加入的樣品對反應體系已無太大影響。

2.3 JH28的16S rDNA序列測定

菌株JH28的16S rDNA部分序列長約1447bp，根據(jù)菌株JH28的16S rDNA測序結(jié)果進行BLASTn分析，結(jié)果表明：菌株JH28與Lactobacillus casei BL23相似性為100%，與Lactobacillus casei ATCC 334相似性為100%。綜合同源性分析，將菌株JH28歸類為干酪乳桿菌，命名為Lactobacillus casei JH28。

3 結(jié)論

本文從自然來源中篩選出了一株具有麥芽糖酶抑制活性的乳酸菌菌株JH28，其MRS發(fā)酵上清及無細胞提取物均對麥芽糖酶具有抑制效果，該菌是否具有潛在輔助治療糖尿病的作用，還需進行動物實驗，以確定其在活體中的功效，并進一步從酶動力學等方面研究該菌相關(guān)成分對麥芽糖酶抑制作用的機理。

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［7］凌代文，東秀珠.乳酸菌分類鑒定及實驗方法［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1999.

［8］L Ramchandran，NP Shah.Proteolytic profiles and angiotensin -l converting enzyme and α-glucosidase inhibitory activities of selected lactic acid bacteria［J］.Food Microbiology and Safety，2008，73（2）：M75-M81l.

［9］Zhang Jian-Fen，Zheng Yu-Guo，Shen Yin-Chu.Inhibitory effect of valienamine on the enzymatic activity of honeybee（Apis cerana Fabr.）α-glucosidase［J］.Pesticide Biochemistry and Physiology，2007，87：73-77.

Screening of lactic acid bacteria with inhibitory effect on maltase

WU Bin-bin1，GUO Ben-heng1，2，*，ZHANG Hao1，WANG Yin-yu2，WU Zheng-jun2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214036，China；2.Technology Center of Bright Dairy Co.，Ltd.，Shanghai 200436，China）

This study used an α-glucosidase inhibitor screening model in vitro targeted at inhibiting maltase activity and found bacterial strain JH28 that could obviously inhibit maltase activity.The supernatant and intra-cellular extracts of JH28 fermented in MRS both had inhibit activity on maltase.Different concentration of the intra-cellular extracts of JH28 was measured while freeze drying after dialysis（MWCO 1000Da，de-ionized water as dialysate），the highest suppression ratio could be 67.19%，and the lC50calculated was 4.12mg/mL.JH28 was also found inhibitory effect of the supernatant on maltase while fermented in skimmed milk.Bacterial strain JH28 was found as Lactobacillus casei though 16S rDNA method which had potential industrial applications.

Lactobacillus；screen；inhibitory；maltase

TS201.3

A

1002-0306（2010）11-0175-03

2009-09-27 *通訊聯(lián)系人

吳彬彬（1985-），女，碩士研究生，主要從事乳品微生物研究。

國家科技支撐計劃“十一五”奶業(yè)重大專項（2006BADO4A14）。