陳仕光， 王志紅， 曹 欣

(廣東工業(yè)大學(xué)土木與交通工程學(xué)院，廣東廣州 510006)

典型性微量金屬元素對(duì)藻華的激勵(lì)趨勢(shì)探討

陳仕光， 王志紅*， 曹 欣

(廣東工業(yè)大學(xué)土木與交通工程學(xué)院，廣東廣州 510006)

Fe、Mn、Zn等典型性微量營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)藻類(lèi)增殖的影響是探討藻華成因分析的重要內(nèi)容. 通過(guò)設(shè)計(jì)系列正交實(shí)驗(yàn)，研究代表性微量元素Fe、Mn、Zn對(duì)常見(jiàn)藻華生物(藍(lán)藻、綠藻)的影響，結(jié)果表明：P、Fe、Mn、Zn的質(zhì)量濃度變化對(duì)藻生長(zhǎng)速率激勵(lì)效果明顯，顯著性順序依次為：Zn>P>Fe>Mn. 通過(guò)單獨(dú)添加Fe、Mn、Zn的方法進(jìn)一步進(jìn)行了藻增長(zhǎng)潛力實(shí)驗(yàn). 結(jié)果表明：在Fe、Mn、Zn質(zhì)量濃度分別為0.20、0.13、0.033 mg/L時(shí)，藻類(lèi)生長(zhǎng)速率達(dá)到最大值，低于該質(zhì)量濃度時(shí)，金屬離子質(zhì)量濃度與藻類(lèi)生長(zhǎng)速率、生物量呈正相關(guān)；高于該質(zhì)量濃度時(shí)，金屬離子質(zhì)量濃度與藻生長(zhǎng)水平呈反相關(guān)；擬合Fe、Mn、Zn質(zhì)量濃度與藻生長(zhǎng)速率之間的數(shù)值關(guān)系，分別得到相關(guān)系數(shù)為0.93、0.87、0.90的回歸方程；根據(jù)微量元素與藻類(lèi)生長(zhǎng)速率之間的相關(guān)性，可以對(duì)藻華的爆發(fā)時(shí)間或程度進(jìn)行一定精度的預(yù)測(cè). 正交實(shí)驗(yàn)中，錳的激勵(lì)作用受微量元素之間的競(jìng)爭(zhēng)性抑制而被消弱，反映出錳的作用機(jī)理比較復(fù)雜，有待于深入研究.

微量金屬元素； 藻華； 生長(zhǎng)速率； 生物量； 激勵(lì)

有害藻華的發(fā)生對(duì)當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)、生態(tài)、人類(lèi)身體健康造成嚴(yán)重危害，尋找有害藻華的誘發(fā)因素成為人們共同努力的目標(biāo). 長(zhǎng)期以來(lái)，關(guān)于藻華(赤潮)成因的研究均側(cè)重于N、P及N∶P比對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)速率及最終生物量的影響評(píng)估方面，直到上世紀(jì)80年代，MARTIN等人在北太平洋發(fā)現(xiàn)在高營(yíng)養(yǎng)低葉綠素(HNLC)的水體，浮游生物產(chǎn)量與鐵(Fe)相關(guān)，以及后來(lái)在北太平洋、赤道地區(qū)、瑞典內(nèi)陸湖泊等地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)鐵對(duì)初級(jí)生產(chǎn)力有所限制后，人們?cè)桨l(fā)清晰地認(rèn)識(shí)到微量元素在藻華(赤潮)形成過(guò)程中的重要性[1-4].

最近20年來(lái)，人們?cè)谔綄の⒘吭嘏c藻華因果關(guān)系方面取得了一系列的成果，對(duì)可能誘發(fā)藻類(lèi)增殖的微量元素種類(lèi)及每種元素的作用機(jī)理進(jìn)行了細(xì)致的分析和深入的揭示，目前的研究成果主要體現(xiàn)在生物學(xué)的微觀角度，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)：鐵是葉綠素合成中某些酶或酶輔基的活化劑，補(bǔ)充鐵可以提高藻類(lèi)各種酶的活性；適量錳可加快藻類(lèi)光合速率；Cu2+作為藻類(lèi)呼吸和光合作用中多種酶的輔助因子，能提高酶的表達(dá)量；鋅可促進(jìn)各種酶的活性[5-13].

這些研究在水處理研究領(lǐng)域則意味著：金屬離子可能在藻華爆發(fā)中發(fā)揮積極的作用. 但關(guān)于這些微量營(yíng)養(yǎng)發(fā)揮作用的程度，與常規(guī)營(yíng)養(yǎng)因素影響的比較，以及各種金屬對(duì)藻類(lèi)產(chǎn)生不同生物促進(jìn)作用(促進(jìn)或抑制)的濃度限值還很少報(bào)道，而這方面的研究對(duì)于深化認(rèn)識(shí)藻華誘發(fā)機(jī)理，為藻華的防控提供科學(xué)依據(jù)至關(guān)重要.

Fe、Mn和Zn等3種元素因分布廣泛及高度可生物利用，本研究中作為微量元素中的代表，結(jié)合常規(guī)營(yíng)養(yǎng)磷(P)，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，比較P與Fe、Mn、Zn影響的顯著關(guān)系，并通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分析不同的Fe、Mn、Zn對(duì)不區(qū)分藻種的混合群體的作用效應(yīng)，為富營(yíng)養(yǎng)化水源藻華的預(yù)警和防控提供技術(shù)保障.

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究的藻種取自于廣州大學(xué)城廣東工業(yè)大學(xué)人工湖(湖心N 23°02′,E113°23′). 該湖原水藻類(lèi)密度在2×103～6×104個(gè)/L不等，種類(lèi)主要為藍(lán)藻和綠藻(藻種群中藍(lán)藻、綠藻為優(yōu)勢(shì)藻種). 實(shí)驗(yàn)期間藻種分布情況及比例較穩(wěn)定. 培養(yǎng)液采用朱氏改良10號(hào)[14]. 營(yíng)養(yǎng)成分和項(xiàng)目分析所用試劑均為分析純. 實(shí)驗(yàn)確定的因素有：P(Na3PO4·12H2O), Fe(FeCl3), Mn(MnSO4·H2O), Zn(ZnSO4·7H2O). Na3PO4采用蒸餾水配制，為避免金屬離子發(fā)生沉淀反應(yīng)，F(xiàn)eCl3、MnSO4、ZnSO4采用0.75 mmol/L EDTA溶液配制.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

為了比較P、Fe、Mn、Zn對(duì)藻生長(zhǎng)影響的相對(duì)大小，粗略判斷各種元素對(duì)藻生長(zhǎng)作用范圍，先進(jìn)行第1階段的P、Fe、Mn、Zn正交試驗(yàn)，采用L16(45)正交表安排實(shí)驗(yàn)順序. 實(shí)驗(yàn)水平的選取以各自元素在水體中的波動(dòng)范圍及藻類(lèi)對(duì)金屬離子的耐受度為依據(jù)[15-16]. 為了在有限的實(shí)驗(yàn)次數(shù)下，元素水平能覆蓋金屬元素對(duì)藻類(lèi)的有效作用范圍，第4水平均采用較高值. 因素水平如表1所示.

表1 因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal tests

第2階段，F(xiàn)e、Mn、Zn單因素實(shí)驗(yàn)，單因素實(shí)驗(yàn)的水平閾值根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)中有效濃度水平來(lái)確定，以0.618法設(shè)計(jì)下一系列的因素水平[17]，得到的實(shí)驗(yàn)順序及各組水平如表2所示.

表2 單因子實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.2 Levels of single factor tests

試驗(yàn)前，先對(duì)原水藻種擴(kuò)大培養(yǎng)1周，取一定體積的含藻原水用0.2 μm 微孔濾膜在負(fù)壓下過(guò)濾，再以5 000 r/min的速度離心15 min，棄掉上清液，然后用0.1 mmol/L EDTA重懸以洗去細(xì)胞表面附帶的微量金屬離子，重復(fù)離心3次，使得待試驗(yàn)的藻細(xì)胞含微量金屬不超過(guò)10-9mol/L. 經(jīng)過(guò)上述程序后，將潔凈藻細(xì)胞用無(wú)菌水稀釋接種于不含P、Fe、Mn、Zn的培養(yǎng)基中進(jìn)行饑餓培養(yǎng)，2 d以后加入P、Fe、Mn、Zn元素，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)周期，實(shí)驗(yàn)初始藻密度為1.3×104～3.4×104個(gè)/L. 當(dāng)生物量連續(xù)3 d出現(xiàn)下降時(shí)，即認(rèn)為已達(dá)到飽和值，隨即停止實(shí)驗(yàn).

試驗(yàn)采用自行設(shè)計(jì)的微循環(huán)藻類(lèi)培養(yǎng)箱作為培養(yǎng)容器. 于室溫條件靜置培養(yǎng)，每天接受光照強(qiáng)度4 000～5 000 Lux，光暗比為14 ∶10，每日定時(shí)混勻3～4次，以促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)，減少器壁效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2009年5月—9月，水溫日變幅1.5～2.5 ℃，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間水溫變化范圍為25.6～31.5 ℃.

1.3測(cè)試方法

實(shí)驗(yàn)以藻細(xì)胞生長(zhǎng)速率和峰值細(xì)胞產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo).

每天8:30定時(shí)取樣，取樣前先將培養(yǎng)箱水體混合均勻，準(zhǔn)確吸取10 mL樣品加入適量福爾馬林固定藻細(xì)胞，然后用滴管吸取l滴含藻細(xì)胞的液體置于載玻片上，在10×20倍顯微鏡下，對(duì)藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)2片取其平均值，繪制生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算藻峰值(個(gè)/L)及生長(zhǎng)速率μ(d-1). 其中藻生長(zhǎng)速率μ(d-1)的計(jì)算方法為：

(1)

式(1)中：X1為t1時(shí)的細(xì)胞數(shù)(個(gè)/L)；X2為t2時(shí)的細(xì)胞數(shù)(個(gè)/L)；t為培養(yǎng)時(shí)間(d).

總磷(TP):鉬銻抗分光光度法;鐵(Fe):鄰菲羅琳分光光度法;錳(Mn):焦磷酸鉀-乙酸鈉分光光度法；鋅(Zn):雙硫腙分光光度法[18]. 使用的儀器有：重慶奧特光學(xué)儀器有限公司的BK系列生物顯微鏡；上海華巖儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)的HL-JS藻類(lèi)計(jì)數(shù)框；北京瑞利分析儀器公司的VIS-723G可見(jiàn)分光光度計(jì).

2 結(jié)果與分析

2.1一階段正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

正交實(shí)驗(yàn)在于預(yù)估Fe、Mn和Zn對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)產(chǎn)生不同激勵(lì)作用(促進(jìn)或抑制)的敏感濃度區(qū)間，為單因素實(shí)驗(yàn)水平設(shè)計(jì)提供參考. 同時(shí)也可以對(duì)這4種元素的影響顯著程度進(jìn)行比較. 由于磷是已證實(shí)的對(duì)藻類(lèi)有顯著影響的營(yíng)養(yǎng)因子，實(shí)驗(yàn)以P作為對(duì)照物來(lái)評(píng)價(jià)3種微量元素對(duì)藻類(lèi)影響的顯著程度. 各組初始狀態(tài)及藻生長(zhǎng)效果見(jiàn)表3.

為能直接反應(yīng)各質(zhì)量濃度水平對(duì)藻生長(zhǎng)速率的影響，通過(guò)式(1)計(jì)算得到表4. 表4中的平均生長(zhǎng)速率是指每個(gè)因素的同一水平所在培養(yǎng)周期的生長(zhǎng)速率均值.

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及直觀分析表Tab.3 Results of orthogonal tests and direct analysis

從表4可看出，F(xiàn)e、Zn質(zhì)量濃度分別對(duì)應(yīng)為0.05、0.010 mg/L時(shí)，藻平均生長(zhǎng)速率較0.01、0.001 mg/L條件下都有增加，表明增加的金屬質(zhì)量濃度有刺激藻生長(zhǎng)的效果.然而，當(dāng)Fe、Zn含量分別達(dá)到0.10 mg/L、0.040 mg/L時(shí)，藻生長(zhǎng)速率出現(xiàn)顯著下降，到1.00、0.160 mg/L時(shí)進(jìn)一步降低；錳在0.01～0.05 mg/L區(qū)間內(nèi)時(shí)，藻生長(zhǎng)速率表現(xiàn)為增加趨勢(shì)，在0.05～0.10 mg/L區(qū)間內(nèi)時(shí)，表現(xiàn)為減少趨勢(shì)，而在0.10～1.00 mg/L區(qū)間內(nèi)時(shí)，藻生長(zhǎng)速率又表現(xiàn)出了增加趨勢(shì). 依據(jù)各因素水平的生長(zhǎng)速率極差判斷：4種物質(zhì)的顯著性順序依次是：Zn>P>Fe>Mn.

正交實(shí)驗(yàn)中，盡管可以反應(yīng)出一定的趨勢(shì)性關(guān)系，如在Fe:0.01～0.05 mg/L; Zn:0.001～0.010 mg/L區(qū)間變化時(shí)，表現(xiàn)為藻生長(zhǎng)速率的增加趨勢(shì)，在Fe:0.05～1.00 mg/L; Zn:0.010～0.160 mg/L區(qū)間變化時(shí)，表現(xiàn)為減少的趨勢(shì)，但無(wú)法確切地了解鐵、錳、鋅質(zhì)量濃度與藻生長(zhǎng)速率之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，藻類(lèi)生長(zhǎng)的最適質(zhì)量濃度點(diǎn)也無(wú)法確定. 為了得出Fe、Mn、Zn質(zhì)量濃度與藻生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)之間的數(shù)值關(guān)系，采用水平梯度更精密的單因素實(shí)驗(yàn)，依次確定3種元素對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)的激勵(lì)規(guī)律.

表4 各因素各水平的平均生長(zhǎng)速率Tab.4 Mean growth rate of each factor level

從表4看出，藻類(lèi)在4個(gè)Fe、Mn、Zn質(zhì)量濃度區(qū)間內(nèi)，平均生長(zhǎng)速率差異明顯，即鐵、錳、鋅不同的質(zhì)量濃度狀態(tài)會(huì)對(duì)藻類(lèi)產(chǎn)生不同的激勵(lì)效果，表明正交實(shí)驗(yàn)中鐵、錳、鋅的4個(gè)水平皆處于對(duì)藻類(lèi)產(chǎn)生激勵(lì)作用的敏感濃度區(qū)間內(nèi). 根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定鐵的質(zhì)量濃度閾值為0.01～1.00 mg/L；錳為0.01～1.00 mg/L；鋅為0.001～0.100 mg/L，見(jiàn)表2所示.

2.2二階段單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 Fe的激勵(lì)規(guī)律 為了充分體現(xiàn)鐵的生物活性，采用無(wú)鐵朱氏培養(yǎng)液作為培養(yǎng)基質(zhì). 在添加不同F(xiàn)e(避免發(fā)生價(jià)態(tài)轉(zhuǎn)化和沉淀，采用有機(jī)絡(luò)合形式Fe3+)條件下的藻生長(zhǎng)曲線如圖1所示，生長(zhǎng)速率和最終藻高峰產(chǎn)量分別如圖2、圖3所示.

圖1 不同F(xiàn)e質(zhì)量濃度下藻生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of algae under different concentration of Fe

圖2 不同F(xiàn)e質(zhì)量濃度對(duì)生長(zhǎng)速率的影響Fig.2 Influence of different concentration of Fe on growth rate

圖3 不同F(xiàn)e質(zhì)量濃度對(duì)藻生物量高峰值的影響

Fig.3 Influence of different concentration of Fe on algae biomass maximum.

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，鐵對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)的影響分3種情況：

(1)缺鐵條件：在0.01 mg/L時(shí)，初期細(xì)胞增長(zhǎng)緩慢，第7 d以后，開(kāi)始出現(xiàn)快速增長(zhǎng)，到第10 d時(shí)細(xì)胞密度不再增加，最大生物量止于40×104個(gè)/L，為實(shí)驗(yàn)平均峰值的61.4%. 表明0.01 mg/L的鐵含量尚不能滿足藻類(lèi)生長(zhǎng)潛力的充分發(fā)揮. 原因在于，鐵是藻生物體內(nèi)光合反應(yīng)和呼吸反應(yīng)中不可或缺的電子載體，缺鐵直接影響藻細(xì)胞的新陳代謝活動(dòng). 因此，藻類(lèi)生長(zhǎng)潛力的發(fā)揮必需足夠量的可利用鐵來(lái)保證.

(2)適量鐵條件：從圖1看出，在初始鐵投加量達(dá)到0.15 mg/L時(shí)，藻細(xì)胞在第8 d出現(xiàn)了明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)跡象，而0.20 mg/L和0.29 mg/L等2個(gè)系列從第4 d起就出現(xiàn)了對(duì)數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì).這是由于，當(dāng)有足夠鐵可供藻類(lèi)利用時(shí)，藻類(lèi)生命活動(dòng)恢復(fù)正常，使藻類(lèi)迅速進(jìn)入旺盛的繁殖階段. 隨著鐵質(zhì)量濃度的提高，細(xì)胞峰值顯著增加，在鐵為0.15 mg/L時(shí)，藻生物量到第12 d達(dá)到最高峰，密度為50×104個(gè)/L左右，當(dāng)鐵上升至0.20 mg/L后，生物量高峰超過(guò)100×104個(gè)/L. 表明鐵是藻類(lèi)生物量的重要主導(dǎo)因素. 如圖3所示，當(dāng)鐵質(zhì)量濃度從0.01 mg/L提高到0.20 mg/L時(shí)，細(xì)胞密度增加近4倍.

(3)鐵過(guò)量條件：從圖2、圖3看出，在初始投加的鐵質(zhì)量濃度高于0.38 mg/L后，生長(zhǎng)速率和峰值細(xì)胞密度明顯不如幾個(gè)低鐵系列. 尤其是0.62 mg/L和1.00 mg/L 2個(gè)組，在培養(yǎng)的初期，藻細(xì)胞密度不但沒(méi)有增加，反而有下降趨勢(shì)，在經(jīng)歷了5 d的調(diào)整以后雖然恢復(fù)了生長(zhǎng)，但極其緩慢，表明藻類(lèi)受到了鐵的抑制作用. 這可以從藻生命活動(dòng)的特點(diǎn)進(jìn)行分析，藻細(xì)胞對(duì)金屬離子的吸收缺乏主動(dòng)選擇性，當(dāng)生長(zhǎng)環(huán)境出現(xiàn)鐵富余時(shí)，大量的鐵離子聚集在藻細(xì)胞表面并源源不斷地進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)，超過(guò)了藻類(lèi)的代謝能力，過(guò)量的鐵離子與帶負(fù)電荷的藻細(xì)胞壁發(fā)生電荷吸引，以及與一些含硫、氮、氧的官能團(tuán)發(fā)生鰲和反應(yīng)，造成對(duì)藻細(xì)胞的毒害作用[4]，而藻類(lèi)細(xì)胞受到的抑制作用與富余的鐵含量呈正比.

本次實(shí)驗(yàn)各批次均在同溫同光照條件下進(jìn)行，同一對(duì)照組里使用的培養(yǎng)基質(zhì)完全相同，因此，藻類(lèi)生長(zhǎng)的差異完全可以看做是由Fe質(zhì)量濃度的變化引起的. 根據(jù)圖3、圖4的結(jié)果，F(xiàn)e質(zhì)量濃度按細(xì)胞生長(zhǎng)密度排序依次是：0.20>0.29>0.24>0.15>0.38>0.01>0.62>1.0(mg/L)，根據(jù)Fe質(zhì)量濃度與藻類(lèi)生長(zhǎng)速率數(shù)值上的對(duì)應(yīng)關(guān)系，采用最小二乘法擬合藻生長(zhǎng)速率與鐵質(zhì)量濃度之間的函數(shù)關(guān)系，得到回歸方程如下：

y=0.001x3-0.0234x2+0.1248x+0.1997

(R2=0.93)，

(2)

式(2)中x為Fe3+質(zhì)量濃度(mg/L)，y為藻生長(zhǎng)速率.

2.2.2 Mn的激勵(lì)規(guī)律 試驗(yàn)所用的藻細(xì)胞經(jīng)過(guò)了細(xì)致的潔凈處理(反復(fù)離心，并用0.75 mmol/L EDTA溶液沖洗). 試驗(yàn)用的MnSO4采用0.75 mmol/L EDTA溶液配制，使細(xì)胞表面及培養(yǎng)基質(zhì)中錳的含量不超過(guò)5.6×10-5mg/L. 因此，可認(rèn)為初始添加的錳即是藻類(lèi)唯一的外部錳源.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4、圖5、圖6所示.

結(jié)合圖4、圖5進(jìn)行觀察，藻類(lèi)在錳質(zhì)量濃度為0.13 mg/L的培養(yǎng)環(huán)境里生長(zhǎng)最好，當(dāng)初始錳含量在0.24 mg/L及以上時(shí)，生長(zhǎng)速率與細(xì)胞數(shù)量均已開(kāi)始下降. 到了0.62 mg/L條件時(shí)，圖4顯示，藻細(xì)胞直到第10 d才出現(xiàn)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，而當(dāng)錳為1.00 mg/L時(shí)，生長(zhǎng)曲線接近一條水平直線，始終沒(méi)有出現(xiàn)對(duì)數(shù)增長(zhǎng). 生物量與生長(zhǎng)速率只有最高值的13.0%和47.4%.

圖4 不同Mn質(zhì)量濃度下藻的生長(zhǎng)曲線

Fig.4 Growth curve of algae under different concentration of Mn

圖5 不同Mn質(zhì)量濃度對(duì)生長(zhǎng)速率的影響

Fig.5 Influence of different concentration of Mn on growth rate

圖6 不同Mn質(zhì)量濃度對(duì)藻生物量的影響

Fig.6 Influence of different concentration of Mn on algae biomass

在0.13～0.24 mg/L之間時(shí)，屬于藻生長(zhǎng)的最佳質(zhì)量濃度范圍.

在0.24～1.00 mg/L之間時(shí)，錳對(duì)藻類(lèi)的生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯抑制作用，藻生物量與質(zhì)量濃度呈反相關(guān)關(guān)系. 認(rèn)為抑制作用與藻生物體內(nèi)的一種葉綠素降解酶有關(guān)，當(dāng)錳離子的含量超過(guò)一定水平后，這種酶的活性就會(huì)超過(guò)葉綠素抗氧化酶的活性，原有的平衡被打破，造成葉綠素的含量下降[12].

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在控制營(yíng)養(yǎng)、光照為最佳狀態(tài)時(shí)，錳質(zhì)量濃度的變化有可能使藻獲得非常高的細(xì)胞比增長(zhǎng)速率(0.478)和細(xì)胞密度(118×104個(gè)/L),產(chǎn)生嚴(yán)重藻華.

按生物量促進(jìn)效果(細(xì)胞峰值)大小排序的錳質(zhì)量濃度依次為0.13>0.15>0.24>0.38>0.09>0.01>0.62>1.0 (mg/L),同樣采用最小二乘法擬合藻生長(zhǎng)速率與Mn質(zhì)量濃度關(guān)系，可得到方程式為：

y=-0.0138x2+0.1093x+0.2418(R2=0.87)，

(3)

式(3)中x為Mn2+質(zhì)量濃度(mg/L)，y為藻生長(zhǎng)速率.

根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以認(rèn)為0.13～0.24 mg/L是藻類(lèi)對(duì)錳需求的飽和質(zhì)量濃度.

2.2.3 Zn的激勵(lì)規(guī)律 藻類(lèi)生物體中鋅含量極少(每克藻干細(xì)胞含Zn 3.64～64.8 μg)[19]，因而針對(duì)鋅試驗(yàn)的精度要求也相應(yīng)提高，本實(shí)驗(yàn)采用0.75 mmol/L EDTA配制溶解Zn2+溶液，盡量避免Zn2+的吸附效應(yīng)，使得外加的Zn質(zhì)量濃度變化梯度得以很好的體現(xiàn). 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7、圖8、圖9所示.

從圖7看出，藻類(lèi)生長(zhǎng)在細(xì)微的Zn梯度差異條件下表現(xiàn)出了顯著的生長(zhǎng)差異. 整體來(lái)看，低Zn的3個(gè)組(0.033 mg/L及以下)藻類(lèi)長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于高Zn組(0.038 mg/L及以上). 以往關(guān)于Zn抑制浮游初級(jí)生產(chǎn)力的研究相對(duì)較少，一是難以檢測(cè)到痕量Zn的變化，二是因?yàn)閆n的部分功能可以由其它元素如Co、Cu取代[20]，因此，即使在缺Zn狀態(tài)，藻類(lèi)也不一定表現(xiàn)出生長(zhǎng)受限. 本次實(shí)驗(yàn)，在前3個(gè)鋅遞增的系列中，藻類(lèi)還是表現(xiàn)出明顯的增加趨勢(shì)(鋅為0.033 mg/L時(shí)，藻類(lèi)生長(zhǎng)速率和生物量比在0.001 mg/L時(shí)分別增加了17%和15%)，表明微量的Zn(0.001～0.033 mg/L)增加對(duì)藻生長(zhǎng)會(huì)起到一定正向刺激作用.

圖7 不同Zn質(zhì)量濃度下藻的生長(zhǎng)曲線

圖8 不同Zn質(zhì)量濃度對(duì)生長(zhǎng)速率的影響

Fig.8 Influence of different concentration of Zn on growth rate

圖9 不同Zn質(zhì)量濃度對(duì)藻生物量的影響

Fig.9 Influence of different concentration of Zn on algae biomass

然而，當(dāng)初始鋅超過(guò)0.033 mg/L后，藻峰值生物量急劇下降(見(jiàn)圖8)，由此得出結(jié)論，對(duì)藻類(lèi)造成抑制效應(yīng)的鋅質(zhì)量濃度介于0.030～0.040 mg/L左右，超過(guò)此質(zhì)量濃度后，藻類(lèi)即處于低生長(zhǎng)率狀態(tài).

使用重金屬(包括Zn)抑制藻類(lèi)，是目前普遍采用的方法，值得注意的是，不同的藻種群對(duì)Zn的耐受范圍有異，但大多數(shù)藻類(lèi)處于6.5×10-4mg/L到6.5×10-2mg/L以內(nèi)[6]. 根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)實(shí)驗(yàn)中的藻類(lèi)群體，其最低負(fù)效應(yīng)質(zhì)量濃度出現(xiàn)在0.038 mg/L處，雖然有個(gè)別藻種在0.100 mg/L時(shí)還有生長(zhǎng)，但大多數(shù)種類(lèi)在鋅高于0.047 mg/L后已死亡或進(jìn)入長(zhǎng)時(shí)間的遲滯期.

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，鋅元素的特點(diǎn)可總結(jié)為需求量少，但敏感度高，擬合方程為：

y=-0.0152x2+0.0581x+0.5766(R2=0.899)，

(4)

式(4)中x為Zn2+質(zhì)量濃度(mg/L)，y為藻生長(zhǎng)速率.

3 討論

正交實(shí)驗(yàn)中，在元素質(zhì)量濃度為：P(0.16 mg/L), Fe(0.05 mg/L), Mn(0.05 mg/L), Zn(0.010 mg/L)時(shí)，藻生長(zhǎng)速率出現(xiàn)最大值，而在單因素實(shí)驗(yàn)中，在金屬質(zhì)量濃度分別為Fe：0.20～0.29 mg/L；Mn：0.13～0.24 mg/L；Zn：0.033～0.038 mg/L處藻生長(zhǎng)最快. 相同質(zhì)量濃度下，正交實(shí)驗(yàn)所反應(yīng)出的金屬元素激勵(lì)趨勢(shì)與單因素實(shí)驗(yàn)有些許差異，對(duì)此認(rèn)為有以下幾種可能：

首先是由于正交實(shí)驗(yàn)中，水平設(shè)計(jì)跨度大，無(wú)法反應(yīng)出確切的最適質(zhì)量濃度點(diǎn)；其次是正交實(shí)驗(yàn)時(shí)添加的金屬元素種類(lèi)較多，作用機(jī)理復(fù)雜，金屬總量較單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)要高，故藻類(lèi)對(duì)單一金屬所需的質(zhì)量濃度值偏低；另外，各種元素之間的相互作用可能導(dǎo)致有些元素的作用效果減弱或增強(qiáng)，從而產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異. 如錳在單因素實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)藻生長(zhǎng)速率的影響極差為0.251，遠(yuǎn)比正交試驗(yàn)(0.094)顯著，究其原因認(rèn)為：與正交實(shí)驗(yàn)時(shí)各種金屬元素之間的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用有關(guān)，有研究表明，有一定量的Cu或Zn時(shí)，藻類(lèi)對(duì)Mn的需求將減少，即藻類(lèi)對(duì)金屬離子具有選擇性吸收特性，一種金屬元素會(huì)替代藻類(lèi)對(duì)另一種金屬的需求[11,13]. 這是由于金屬離子在與藻細(xì)胞分子結(jié)合時(shí)，具有相似功能的金屬之間會(huì)發(fā)生相互取代，結(jié)合能力強(qiáng)的元素優(yōu)先被利用[6]. 這也意味著，在尋找藻華的誘導(dǎo)因素時(shí)，不能只考慮與藻類(lèi)生長(zhǎng)直接相關(guān)的物質(zhì)，還需考慮可能與這些物質(zhì)發(fā)生相互關(guān)系的其它因子的變化情況.

二組實(shí)驗(yàn)的不同意義在于，正交實(shí)驗(yàn)反應(yīng)了P、Fe、Mn、Zn各次影響的大小、主次關(guān)系，確定了金屬元素對(duì)藻生長(zhǎng)產(chǎn)生激勵(lì)作用的敏感濃度區(qū)間，單因素實(shí)驗(yàn)分別確定了Fe、Mn、Zn質(zhì)量濃度變化與藻生長(zhǎng)速率之間的相關(guān)關(guān)系. 當(dāng)水體只有一種元素變化時(shí)，可運(yùn)用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)藻類(lèi)的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，當(dāng)有多種元素變化時(shí)，可以運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)其影響大小進(jìn)行比較，找出主要因素.

4 結(jié)論

(1)當(dāng)Fe質(zhì)量濃度低于0.20 mg/L時(shí)，藻生長(zhǎng)速率、生物量與Fe質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，高于0.29 mg/L時(shí)，呈反相關(guān)；Mn含量低于0.13 mg/L時(shí)，Mn質(zhì)量濃度與藻生長(zhǎng)速率、生物量呈正相關(guān)，Mn高于0.24 mg/L時(shí)，呈反相關(guān)；在Zn不超過(guò)0.033 mg/L的條件下，增加Zn質(zhì)量濃度促進(jìn)藻類(lèi)生長(zhǎng)，超過(guò)0.038 mg/L后，抑制藻類(lèi)生長(zhǎng). 最適藻類(lèi)生長(zhǎng)的Fe、Mn、Zn質(zhì)量濃度分別為0.20、0.13、0.033 mg/L.

(2)對(duì)藻生長(zhǎng)速率影響的顯著性順序依次是：Zn>P>Fe>Mn；

(3)用回歸趨勢(shì)來(lái)描述Fe、Mn、Zn對(duì)藻生長(zhǎng)速率的激勵(lì)函數(shù)，得到的方程分別為:

Fe：y=0.001x3-0.0234x2+0.1248x+0.1997

(R2=0.93)；

Mn：y=-0.0138x2+0.1093x+0.2418(R2=0.87)；

Zn：y=-0.0152x2+0.0581x+0.5766(R2=0.899).

(4)藻類(lèi)最大生長(zhǎng)速率在單因素狀態(tài)下比在正交實(shí)驗(yàn)狀態(tài)下需要的金屬元素質(zhì)量濃度要高，因此對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)的預(yù)測(cè)需考慮在單一因素的變化和多種因素變化條件下的異同.

[1] MARTIN J H, FITZWATER S E, GORDON R M. Iron deficiency limits phytoplankton growth in Antarctic waters[J]. Global Biogeochemical Cycles,1990, 4: 52-55.

[2] TOBIAS V, LARS J T. Iron constraints on planktonic primary production in oligotrophic lakes[J].Ecosystems,2006 (9):1094-1105.

[3] SUN B K,YASUNORI T J, UNNO H J. Influences of iron and humic acid on the growth of the cyanobacterium anabaena circinalis biochemical[J]. Engineering Journal,2005,24:195-201.

[4] KATHLEEN S A, COLIN R A, JAMES W U. Nutrient additions generate prolific growth ofLyngbyamajuscule(cyanobacteria) in field and bioassay experiments[J]. Harmful Algae, 2007,6: 134-151.

[5] PATRICIA P R, PATRICIA E V,RICARDO B. Effect of copper on the photochemical efficiency, growth,and chlorophyll a biomass of natural phytoplankton assemblages Environmental[J]. Toxicology and Chemistry,2006,25(1):137-143.

[6] GAISINA L A, KHAIBULLINA L S. Influence of heavy metals on the morphology of the soil algaeXanthonemaexile(Klebs)Silva[J]. Eurasian Soil Science, 2007, 40(3):313-317.

[7] KANAKO N, MASAKAZU M, ICHIRO I. Ability of marine eukaryotic red tide microalgae to utilize insoluble iron[J]. Harmful Algae, 2005, 4: 1021-1032.

[8] KATHLEEN S A,COLIN R A,JAMES W U. In situ field experiment showsLyngbyamajuscula(cyanobacterium) growth stimulated by added iron, phosphorus and nitrogen[J].Harmful Algae,2008,7:389-404.

[9] LANCELOT C, HANNON E, BECQEVORT S, et al. Modeling phytoplankton blooms and carbon export production in the Southern Ocean: dominant controls by light and iron in the Atlantic sector in Austral spring[J]. Deep-Sea Research,Part I:Oceanographic Research Papers,2000,47(9):1621-1662.

[10] MAURICE L, MICHAEL G S, SONIA M. DMSP and DMS dynamics during a mesoscale iron fertilization experiment in the Northeast Pacific-Part I:Temporal and vertical distributions[J]. Deep-Sea Research, Part II:Topical Studies in Oceanography, 2006,53: 2353-2369.

[11] WILLIAM G S,SUSAN A H. Interactive effects of external manganese,the toxic metals copper and zinc, and light in controlling cellular manganese and growth in a coastal diatom[J]. Sundu and Huntsman,1998,43(7):1467-1475.

[12] KNAUER K, JABUSCH T, SIGG L. Manganese uptake and Mn(II) oxidation by the alga Scenedesmus subspicatus[J]. Aquat Sci,1999, 61: 44-58.

[13] JEFFREY M R, MILYON R S.Effect of manganese and nickel on growth of selected algae in pH buffered medium[J]. Wat Res,1999,33(10): 2448-2454.

[14] 沈韞芬，章宗涉，龔循矩. 微型生物監(jiān)測(cè)新技術(shù)[M].北京：中國(guó)建筑工業(yè)出版社,1990：146-148.

[15] 雷衍之. 養(yǎng)殖水環(huán)境化學(xué)[M]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2008：140-156.

[16] 張鐵明, 杜桂森, 楊忠山,等. 鋅對(duì)2 種淡水浮游藻類(lèi)增殖的影響[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2006，26(8)：1722-1726.

ZHANG Tieming, DU Guisen,YANG Zhongshan,et al. Effects of zinc on two phytoplanktons in fresh water[J]. Journal of northwestern plants, 2006,26(8):1722-1726.

[17] 吳俊奇，李燕城. 水處理實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京:中國(guó)建筑工業(yè)出版社,2009:6-13.

[18] 國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局. 水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法[M]. 4版. 北京：中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社,2002:101-385.

[19] SHI Y J, HU H H, MA R Y, et al.Improved use of organic phosphate by skeletonema costatum through regulation of Zn2+concentrations[J]. Biotechnology Letters,2004,26:747-751.

[20] MIAO A J, WANG W X, PHILIPPE J.Comparison of Cd,Cu,and Zn toxic effects on four marinephytoplankton by pulse-amplitude-modulated fluorometry[J]. Environmental Toxicology and Chemistry,2008,24(10):2603-2611.

Keywords： trace metal elements; algae bloom; growth rate; biomass; motivation

【責(zé)任編輯 成 文】

RESEARCHONTHEMOTIVATIONTRENDOFTYPICALTRACEELEMENTSONALGAEBLOOM

CHEN Shiguang, WANG Zhihong*, CAO Xin

(Faculty of Civil and Transportation Engineering, Guangdong University of Technology， Guangzhou 510006，China)

The effect of micro-nutrients (Fe, Mn, Zn) on the proliferation of planktonic algae colony is one of the most important contents in the research of cause analysis of algae blooms. Experiments on the impacts of typical micro-nutrients (P, Fe, Mn, Zn) on common algal blooms organisms (cyanobacteria, chlorophyta) were carried out by a series of orthogonal experiments. The results show that these nutrients have significant impacts on algae growth and stimulated cell-specific growth rates with Zinc>Phosphorus>Iron>Manganese. AGP (algae growth potential) experiments by separate addition of iron, manganese and zinc were further performed through single-factor experiment. The data obtained show that maximum algae growth rate appeared when concentration of Fe,Mn,Zn were 0.20 mg/L, 0.13 mg/L, 0.033 mg/L,respectively. Furthermore, a positive motivation to the growth rate and biomass of algae was emerged with the concentrations of Fe, Mn and Zn range from 0.01～0.20, 0.01～0.13, 0.001～0.033 mg/L, while there is a negative motivation with the increase of the concentrations of Fe, Mn and Zn above 0.20, 0.13, 0.033 mg/L, respectively. By fitting the numerical relationships between concentrations of Fe, Mn, Zn and algal cell-specific growth rate, regression equations with correlation coefficient of 0.93, 0.87, 0.90 were obtained respectively. The results make it be able to predict the time and severity of outbreak of algae blooming to a certain precision extent according to the correlation between trace elements and algae growth rate or biomass. Experiment consequence also suggested that the significant levels of Manganese to algae had been severely weakened by the inhibitory effect among multi-microelements during orthogonal experiments. These results reveal that the mechanism of Manganese is rather complicated that further researches are needed to be performed.

2010-01-11

廣東省科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(2007B031700007)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(9151009001000048)

陳仕光(1982—)，男，湖南邵陽(yáng)人，廣東工業(yè)大學(xué)2007級(jí)碩士研究生， Email:luyi813929@163.com;王志紅(1975—)，女，江西贛州人，博士，廣東工業(yè)大學(xué)教授，主要研究方向：微污染水源預(yù)警及處理技術(shù)，Email:gdwzhihong@126.com.

* 通訊作者

1000-5463(2010)02-0082-08

TU991

A