黃娟，馬建華

(集美大學(xué) 生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

亞硝胺是目前所知的最強(qiáng)的化學(xué)致癌物質(zhì)之一，亞硝胺能引起人和動(dòng)物肝臟等多種器官的惡性慢性腫瘤.在人體胃的酸性環(huán)境中，過(guò)量的亞硝酸鹽也可以轉(zhuǎn)化為亞硝胺，清除體內(nèi)亞硝酸鹽是防止癌癥的有效途徑[1].水楊酸(SA)和水楊酸甲酯(MS)天然存在于一些植物體內(nèi)，具有鎮(zhèn)靜止痛、清熱解毒等功能，是醫(yī)藥、食品、香料、染料和農(nóng)藥等工業(yè)的重要中間體[2-4].近年來(lái)，SA、MS的生物功能不斷被發(fā)現(xiàn)，如有關(guān)SA、MS是植物對(duì)外界傷害(機(jī)械傷害，食草動(dòng)物、昆蟲、病原菌浸染)做出反應(yīng)而表達(dá)抗性基因的信號(hào)分子的相關(guān)研究報(bào)道[5].但目前SA、MS諸多生物功能的分子機(jī)制尚不完全明了，SA、MS是否具有對(duì)亞硝胺合成的阻斷效果呢？本研究工作以254 nm紫外光為輻照源，利用穩(wěn)態(tài)分析方法分別測(cè)定SA、MS對(duì)亞硝胺合成的阻斷率，同時(shí)探討濃度、pH值、反應(yīng)時(shí)間等影響因子對(duì)SA、MS阻斷效果的影響，并與抗壞血酸作用效果進(jìn)行對(duì)照.所獲研究結(jié)果將不僅有助于進(jìn)一步開(kāi)拓SA、MS的生物功能，而且可為進(jìn)一步闡釋它們光生物活性作用的分子機(jī)制提供重要依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器和試劑ZF-20C 暗箱式紫外分析儀(上海寶山顧村電光儀器廠)，CARY50紫外-可見(jiàn)分光光度儀(東南化學(xué)儀器有限公司)，UV-2000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司)，HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)，F(xiàn)A51001電子天平(上海精科天平有限公司)，pHS-3TC(0.01級(jí))精密數(shù)顯酸度計(jì)(上海天達(dá)儀器有限公司).

水楊酸(SA)：廣東汕頭西隴化工廠；水楊酸甲酯(MS)：中國(guó)國(guó)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑分公司；抗壞血酸(Vc)：廣東汕頭西隴化工廠；其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水.

1.2實(shí)驗(yàn)方法控制適宜的酸性條件，用二甲胺或鹽酸二甲胺與溫?zé)岬膩喯跛徕c反應(yīng)，即可合成二甲基亞硝胺.其化學(xué)反應(yīng)方程式為[6]：

其實(shí)質(zhì)為：

當(dāng)向樣品(SA或MS)溶液中加入二甲胺與亞硝酸鈉時(shí)，樣品優(yōu)先與亞硝酸鈉作用，使得二甲胺不能與亞硝酸鈉反應(yīng)，達(dá)到阻止亞硝胺生成的目的.據(jù)此可以比較相同條件下生成亞硝胺量的多少來(lái)反映樣品阻斷能力的強(qiáng)弱.

在紫外光照射下，二甲基亞硝胺可分解成二甲基仲胺和亞硝酸根，反應(yīng)式如下：

亞硝酸根與對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，再與α-萘胺偶合生成紅色化合物，使用Cary 50紫外分光光度計(jì)在400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描該化合物的最大吸收波長(zhǎng)，測(cè)出該化合物的吸光度值，即可計(jì)算上述反應(yīng)液中亞硝胺含量的多少[7].

在空氣飽和的狀態(tài)下，以254 nm為紫外輻照波長(zhǎng)，采用紫外光解法，操作及測(cè)定方法按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，同時(shí)做濃度、反應(yīng)時(shí)間等影響因子實(shí)驗(yàn)，并以Vc做對(duì)照.

阻斷率/%=[(A0-A)/A0]×100

式中：A0，未加樣品時(shí)NaNO2的吸光度值(以試劑空白溶液為參比溶液)；A， 加入樣品后NaNO2的吸光度值(以樣品為參比溶液).

2 結(jié)果與分析

2.1吸收光譜使用Cary 50紫外分光光度計(jì)在400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描最大吸收波長(zhǎng)，如圖1.由圖可以看出，加樣品(SA、MS和Vc)與不加樣品(Blank)時(shí)NaNO2經(jīng)著色反應(yīng)后的最大吸收峰在525 nm處，這與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的一致，故選擇525 nm為檢測(cè)波長(zhǎng).

圖1 吸收光譜圖

2.2紫外照射波長(zhǎng)對(duì)亞硝胺合成阻斷率的影響在25 mL比色管中均加入相同體積的樣品(SA或MS)溶液，按照1.2的方法，分別測(cè)試反應(yīng)液在365 nm 和254 nm 紫外波長(zhǎng)照射下對(duì)亞硝胺的阻斷率，結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 不同紫外波長(zhǎng)照射下相同濃度的SA與MS對(duì)亞硝胺的阻斷率

觀察表1可知，254 nm紫外波長(zhǎng)照射下，相同濃度的SA、MS對(duì)亞硝胺的阻斷作用比365 nm 照射下稍微強(qiáng)些，可能是紫外波長(zhǎng)不同照射能量不同，導(dǎo)致二甲基亞硝胺的分解率不同.以下選擇254 nm作為紫外照射波長(zhǎng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究.

表2 樣品濃度與對(duì)亞硝胺合成的阻斷率的劑量關(guān)系

2.3濃度對(duì)亞硝胺合成阻斷效果的影響在25 mL比色管中均加入不同體積的樣品(SA或MS)溶液，按照1.2的方法，測(cè)試不同濃度的樣品在254 nm 紫外波長(zhǎng)照射下對(duì)亞硝胺的阻斷率，結(jié)果見(jiàn)表2.

由表2可以看出，在0.08～1.28 mmol/L范圍內(nèi)，樣品濃度與亞硝胺合成的阻斷效果呈明顯的劑量關(guān)系，但當(dāng)濃度達(dá)到1.28 mmol/L時(shí)，阻斷率增加趨緩.該范圍內(nèi)SA、MS對(duì)亞硝胺合成的阻斷率最大分別可達(dá)55.91%、56.18%.說(shuō)明SA和MS均可有效地阻斷亞硝胺的合成，且相同濃度的SA和MS對(duì)亞硝胺阻斷作用能力的強(qiáng)弱順序?yàn)镸S >SA.

2.4反應(yīng)時(shí)間對(duì)亞硝胺合成阻斷效果的影響在25 mL比色管中均加入6.0 mL濃度為4 mmol/L的的樣品(SA或MS)溶液，按照1.2的方法，分別測(cè)試樣品液反應(yīng)不同時(shí)間對(duì)亞硝胺的阻斷率，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)SA、MS阻斷亞硝胺合成效果的影響

結(jié)果表明，SA、MS阻斷亞硝胺的反應(yīng)速度較快，37 ℃水浴下反應(yīng)1 h時(shí)就已達(dá)到最大阻斷率，此時(shí)SA、MS對(duì)亞硝胺的阻斷率即可分別達(dá)到54.84%、55.06%，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間阻斷率反而下降.本實(shí)驗(yàn)選擇1 h作為反應(yīng)時(shí)間.

圖2 不同pH值對(duì)亞硝胺合成阻斷效果的影響

2.5不同pH值對(duì)亞硝胺合成阻斷率的影響根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，改變緩沖液的pH值，在25 mL比色管中均加入6.0 mL濃度為4 mmol/L的的樣品(SA、MS)溶液，按照1.2的方法，分別測(cè)試反應(yīng)液在254 nm波長(zhǎng)照射下對(duì)亞硝胺的阻斷率，結(jié)果見(jiàn)圖2.

圖3 不同反應(yīng)溫度對(duì)SA、MS對(duì)亞硝胺合成阻斷作用的影響

結(jié)果顯示，SA、MS對(duì)亞硝胺合成的阻斷效果與pH值并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是一個(gè)波動(dòng)過(guò)程.pH ≥ 5.00時(shí)，SA、MS對(duì)亞硝胺的阻斷作用較差，尤其是SA，在pH 6.80時(shí)對(duì)亞硝胺的阻斷率幾乎為零.但在pH 3.00時(shí)SA、MS對(duì)亞硝胺的阻斷效果卻比較好，可分別達(dá)54.84%、55.06%.預(yù)示反應(yīng)體系的pH 值直接影響二甲基亞硝胺的生成，pH 酸性體系有利于SA、MS阻斷亞硝胺的合成.

2.6反應(yīng)溫度對(duì)亞硝胺合成阻斷率的影響根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，改變體系的水浴溫度，在25 mL比色管中均加入6.0 mL濃度為4 mmol/L的的樣品(SA、MS)溶液，按照1.2的方法，分別測(cè)試反應(yīng)液在254 nm波長(zhǎng)照射下對(duì)亞硝胺的阻斷率，結(jié)果見(jiàn)圖3.

由圖3可以看出，在溫度較低或者較高的范圍內(nèi)，SA、MS對(duì)亞硝胺的阻斷效果不是很明顯，而在人體正常溫度范圍(37 ℃左右)，卻有良好的阻斷效果，說(shuō)明SA、MS在人體內(nèi)可以有效地阻斷亞硝胺的合成.

2.7 SA、MS與Vc對(duì)亞硝胺阻斷率的比較已經(jīng)有很多報(bào)道證明了Vc 具有抗氧化作用[8-9]，還有文獻(xiàn)報(bào)道Vc 對(duì)亞硝胺合成的阻斷率亦很強(qiáng)[10]，所以選擇Vc 為參照物，比較SA、MS的阻斷能力.

根據(jù)以上各影響因子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以254 nm紫外線為輻射源，用相同量的SA、MS與Vc 進(jìn)行阻斷反應(yīng)，計(jì)算各自的阻斷率并進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表3.

表4 SA、MS與Vc對(duì)亞硝胺阻斷率的比較

由表3可以看出，同等條件下的SA、MS對(duì)亞硝胺的阻斷能力比Vc弱些，其阻斷能力依次為Vc> MS> SA，說(shuō)明SA、MS均具有較強(qiáng)的阻斷亞硝胺的能力.

3 結(jié)論與討論

SA、MS能有效阻斷亞硝胺的合成.在反應(yīng)時(shí)間1 h、pH3.00、反應(yīng)溫度37 ℃、反應(yīng)濃度為1.28 mmol/L、紫外輻射波長(zhǎng)254 nm的條件下，SA、MS對(duì)亞硝胺合成的阻斷效果最好，與同等條件下的Vc相比較，阻斷能力依次是：Vc> MS> SA.

SA、MS和Vc的結(jié)構(gòu)如右：

一些植物體內(nèi)天然存在SA、MS，它們是植物抗逆(抗病、抗蟲等)的信號(hào)分子.利用植物有效成分阻斷亞硝胺合成是防治癌癥的有效途徑之一；本研究對(duì)SA、MS可有效阻斷強(qiáng)致癌物—亞硝胺合成的功能研究結(jié)果，不僅進(jìn)一步開(kāi)拓了SA和MS生物活性功能，也為天然酚類化合物抗癌生物活性分子作用機(jī)制的闡釋提供了部分科學(xué)依據(jù).

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