潘慧鵬, 戈大慶, 王少麗, 吳青君, 徐寶云, 謝 文, 張友軍

(中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所,北京 100081)

煙粉虱[Bemisia tabaci(Gennadius)]屬半翅目,粉虱科,是一種世界性的多食性害蟲,以植物韌皮部汁液為食,通過直接刺吸為害、傳播植物病毒、引起植物生理混亂、分泌蜜露誘發(fā)真菌病害給作物生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。依據(jù)其寄主范圍、生殖力、為害習性和傳毒能力等方面的差異,至少可以分為24種生物型[3],其中B型煙粉虱是近20年來傳播世界各地并暴發(fā)成災的重要入侵害蟲[3-6],在我國華北和其他地區(qū)發(fā)生并造成嚴重的危害[7],應用分子生物學等手段研究發(fā)現(xiàn)在北京市發(fā)生為害的煙粉虱主要是B型煙粉虱[8-11]。近年來,隨著花卉和其他經(jīng)濟作物苗木的調(diào)運,Q型煙粉虱有從其起源地伊比利亞半島向世界各地擴張蔓延的趨勢。在中國,Q型煙粉虱首次于2003年在云南昆明市的一品紅上發(fā)現(xiàn)[12],隨后在北京、河南、浙江、山東、江蘇等地都發(fā)現(xiàn)了Q型煙粉虱[13-15]。

不同生物型的煙粉虱在形態(tài)學上極其相似,但在酯酶多態(tài)性、核酸多態(tài)性等方面則存在明顯的差異。而快速鑒定煙粉虱的生物型是進一步深入研究、制定相關防治措施的前提。本文利用兩種方法進行煙粉虱生物型的鑒定。第1種是Shatters,Jr等[16]設計的B型煙粉虱和Q型煙粉虱的mtDNA COⅠ基因片段特異性引物,PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測后直接判斷煙粉虱的生物型。第2種是應用Simon等[17]設計的煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段通用引物,PCR產(chǎn)物通過測序判定煙粉虱的生物型。上述兩種方法都證實了2009年采集自蔬菜所3個試驗基地的煙粉虱種群為Q生物型,同時也驗證了Shatters,Jr等[16]設計的B型煙粉虱和Q型煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段的特異性引物能夠很好地鑒別B型煙粉虱和Q型煙粉虱。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

所用的煙粉虱種群于2009年采自蔬菜所的3個試驗基地(表1);對照為本實驗室飼養(yǎng)的B型煙粉虱種群。

表1 2009年煙粉虱樣本來源及相關信息

1.2 酶和試劑

PCR試劑盒購自TaKaRa公司;DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司;蛋白酶K、RNAase購自天根生化科技(北京)有限公司。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 DNA的提取

參考滕海媛[18]的方法并略作修改,將其方法中的第1步改為吸20μL裂解液于封口膜上,將1頭煙粉虱置于提取液中,用0.2 mL PCR管底部將煙粉虱充分研磨勻漿,把勻漿液吸入1.5 mL離心管中,再取40μL裂解液清洗封口膜研磨處,將清洗液與勻漿液合并。

1.4 PCR擴增及電泳

Q型煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段PCR擴增特異性引物[16]分別為5′CTTGGTAACTCTTCTGTAGATGTGTGTT 3′和 5′CCTTCCCGCAGAAGA-AATTTTGTTC 3′;B型煙粉虱 mtDNA COⅠ基因片段PCR擴增特異性引物[16]分別為5′CTAGGGTTTATTGTTTGAGGTCATCATATATTC 3′和 5′AATATCGACGAGGCATTCCCCCT 3′,PCR熱循環(huán)程序[16]為:94℃2 min,94℃30 s,64℃1 min,72℃1 min,共35個循環(huán),最后72℃延伸10 min擴增產(chǎn)物大小分別為303 bp和478 bp。煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段 PCR擴增通用引物[17]分別為 5′TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT3′和 5′CTGAATATCGAGGCATTCC3′。PCR熱循環(huán)程序[13]為:94℃5 min,94℃1 min,50℃1 min,72℃1 min,共34個循環(huán),最后72℃延伸5 min,擴增產(chǎn)物大小為620 bp。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖(0.5×TBE)電泳檢測,在Biorad凝膠成像儀觀察,記錄結果。

1.5 序列測定與比較

用B型煙粉虱和Q型煙粉虱的特異性引物擴增后的電泳檢測結果判斷煙粉虱的生物型;對其中部分樣品應用煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段通用引物擴增得到的PCR產(chǎn)物回收、純化后送到北京擎科生物技術有限公司進行雙向測序。通過同源性比較,鑒定所采集的煙粉虱種群的生物型。

2 結果與分析

2.1 Q型和B型煙粉虱特異性引物擴增結果

使用Q型煙粉虱特異性引物從3個地區(qū)采集到的煙粉虱中均擴增到1條303 bp大小的mtDNA COⅠ基因片段(圖1),應用B型煙粉虱的特異性引物可以從本實驗室飼養(yǎng)的B型煙粉虱中擴增到1條478 bp大小的mtDNA COⅠ基因片段(圖1)。

圖1 B型和Q型煙粉虱特異性引物對田間和溫室內(nèi)煙粉虱的擴增結果

2.2 mtCOⅠ通用引物擴增結果

采用mtCOⅠ通用引物從田間采集的煙粉虱及溫室飼養(yǎng)的B型煙粉虱中均擴增到一條大小為620 bp的mtCOⅠ基因片段(圖2)。經(jīng)回收、純化、測序,進行相似性比對后發(fā)現(xiàn),從海淀區(qū)、昌平區(qū)及廊坊市采集到的煙粉虱種群與以色列Q型煙粉虱(登錄號為AY582869)、美國佛羅里達州B型煙粉虱(登錄號為EF080824)的相似性分別為99.85%、98.80%。所以2009年在海淀區(qū)、昌平區(qū)及廊坊市試驗基地發(fā)生為害的煙粉虱全部為Q生物型(圖3)。

3 討論

一些學者利用對mtDNA COⅠ基因測序和RAPD標記技術對北京部分煙粉虱種群進行了鑒定,發(fā)現(xiàn)在北京市發(fā)生為害的煙粉虱主要是B型煙粉虱[8-11],本實驗室已有的研究表明在2004年3個試驗基地發(fā)生為害的煙粉虱全部為B型[19],而本研究發(fā)現(xiàn)在北京市海淀區(qū)、昌平區(qū)及河北省廊坊市發(fā)生為害的煙粉虱為Q型,故Q型煙粉虱已經(jīng)取代了B型煙粉虱在這些地區(qū)發(fā)生為害。然而,RAPD標記為顯性標記不能有效鑒別雜合子,同時易受反應條件的影響,穩(wěn)定性較差;對mtDNA COⅠ基因測序能夠很好地鑒別煙粉虱生物型,但是這種方法費時、費力,并且價格昂貴。在本研究中,聯(lián)合使用B型和Q型煙粉虱mtCOⅠ基因特異性引物能夠快速地鑒別B型與Q型煙粉虱,該結果與Shatters,Jr等[16]的研究結論是一致的。因此,對于局部地區(qū)煙粉虱B型、Q型混合種群,使用這兩個特異性引物來快速鑒別這2種生物型具有一定的價值。

B型煙粉虱近20年來迅速入侵世界許多地區(qū),并引起部分入侵地土著煙粉虱種群的下降或滅絕,從而成為最受關注的一個生物型[20-21]。而近年來Q型煙粉虱逐漸入侵到B型煙粉虱已經(jīng)建立種群并暴發(fā)的地區(qū),成為繼B型煙粉虱后另一備受關注的研究對象。

Nauen等[22]對采自歐洲不同地區(qū)的煙粉虱種群進行了抗藥性研究,結果發(fā)現(xiàn),西班牙Almeria地區(qū)的Q型煙粉虱對吡蟲啉產(chǎn)生了大于100倍的抗性,除了對新煙堿類藥劑噻蟲嗪、啶蟲脒產(chǎn)生了較高的交互抗性,還對噻嗪酮、硫丹、久效磷等常用殺蟲劑有交互抗性。另外研究還發(fā)現(xiàn)來自意大利和德國的Q型煙粉虱種群在吡蟲啉、噻蟲嗪和啶蟲脒之間也存在較高的交互抗性;且Q型煙粉虱對新煙堿類殺蟲劑的抗性更穩(wěn)定,在未施加殺蟲劑選擇壓力的實驗室條件下,Q型煙粉虱對這類殺蟲劑的抗性在兩年后仍維持在較高水平[22]。Horowitz等[23]的研究發(fā)現(xiàn),以色列地區(qū)的Q型煙粉虱對昆蟲生長調(diào)節(jié)劑類農(nóng)藥如吡丙醚產(chǎn)生了很高的抗性。Roditakis等[24]的研究發(fā)現(xiàn),采自地中?？死锾貚u的許多Q型煙粉虱種群都對吡蟲啉和高效氯氰菊酯產(chǎn)生了高抗性。上述研究結果表明,Q型煙粉虱對一些化學殺蟲劑能夠產(chǎn)生很強且穩(wěn)定的抗藥性以及交互抗性。因此,Q型煙粉虱較B型煙粉虱治理的成本更高、難度更大。

自然條件下Q型煙粉虱競爭取代B型煙粉虱的假說很多。首先,Q型煙粉虱較B型煙粉虱對于很多種藥劑具有較高的抗藥性被很多學者認同[25],它可能決定了B型煙粉虱和Q型煙粉虱在田間的種群動態(tài)和擴張趨勢。如Q型煙粉虱在西班牙的自然條件下較B型煙粉虱發(fā)生量大、為害嚴重,尤其在昆蟲生長調(diào)節(jié)劑類農(nóng)藥如吡丙醚和新煙堿類農(nóng)藥廣泛使用的地區(qū),B型煙粉虱已基本被Q型取代[25]。研究者推測Q型煙粉虱所具備的高抗藥性可能在其競爭取代B型過程中發(fā)揮了重要作用[25]。蔬菜所的3個試驗基地常年種植蔬菜,藥劑使用歷史較長,尤其在過去十幾年新煙堿類藥劑大量用于防治粉虱類害蟲。短短5年時間在蔬菜所基地作物上已經(jīng)采集不到B型煙粉虱,并且目前蔬菜所番茄上發(fā)生的Q型煙粉虱對吡蟲啉的抗性是室內(nèi)飼養(yǎng)B型煙粉虱的819.04倍(未發(fā)表),所以作者推測是因為Q型煙粉虱較B型煙粉虱對于很多種藥劑具有高抗性而導致Q型煙粉虱取代B型煙粉虱在蔬菜所基地作物上發(fā)生為害。但是在自然條件下不同地區(qū)煙粉虱生物型的轉(zhuǎn)換與農(nóng)藥的關系尚需進一步深入研究。

其次,Q型煙粉虱較B型煙粉虱在一些雜草和部分農(nóng)作物上具有更強的生物學優(yōu)勢。比如:在小花錦葵(Malva parvif lora Linn.)、薺[Capsella bursa-pastoris(Linn.)Medic.]、田芥菜[Brassica kaber(DC)]3種不同的雜草上,Q型煙粉虱雌蟲產(chǎn)卵率、化蛹數(shù)、成蟲羽化率等均比B型煙粉虱明顯高[26];在不同品種的番茄上,Q型煙粉虱比B型具有更強的危害性[27];在甜椒上,Q型煙粉虱在17、33℃時平均世代歷期比B型的要短[27]。另外Q型煙粉虱較B型煙粉虱具有更強忍受極端溫度的能力[28],這也可能是Q型煙粉虱取代B型煙粉虱的一個重要因素。弄清楚溫度與煙粉虱種群動態(tài)之間的關系對于改進控制策略和評估它在不同地區(qū)之間的擴張能力也是非常重要的。

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