應小樟 石仕元 胡德新 鄭 琦 魏 威 杭州市紅十字會醫(yī)院骨科 杭州310003

關節(jié)軟骨是一種無血管、神經和淋巴管的組織，缺乏基質干細胞，其自我修復能力極其有限。近幾年國內已先后開展自體骨軟骨鑲嵌移植，并有良好的臨床報道［1，2］。但該方法的軟骨供區(qū)十分缺乏，制約了該技術的廣泛應用。如何克服這種供區(qū)不足的困難，依然是關節(jié)外科醫(yī)生的挑戰(zhàn)。本實驗采用含富集骨髓干細胞松質骨鑲嵌移植修復兔關節(jié)軟骨缺損，并與自體骨軟骨移植進行比較研究。通過大體、光鏡觀察及Wakitani組織學評分，探討新鮮同種異體骨軟骨移植修復關節(jié)軟骨缺損的可行性，為臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 采用健康成年純種新西蘭大白兔16只，雌雄不限，體質量3.0～4.5 kg，由浙江中醫(yī)藥大學提供，飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～22℃。實驗動物分為兩組(自體軟骨移植、含富集骨髓干細胞松質骨移植)，每組8只16膝。兩組動物均不限制運動。手術前觀察所有動物無跛行，雙膝關節(jié)活動正常。

1.2 方法

1.2.1 制備軟骨缺損模型 將兔用3%戊巴比妥鈉，以1m l/kg體重兔耳緣靜脈注射麻醉。兔雙側膝關節(jié)前內側縱行切口，保持髕韌帶完整性，將髕骨翻向外側，顯露股骨髁，在股骨髁中部髕股關節(jié)處用利刀制造相應大小的全層關節(jié)軟骨缺損，深達軟骨下骨質，平均深度約5.0mm。

1.2.2 自體骨軟骨移植 自體移植組用特制取骨器在股骨外髁非負重區(qū)取相應大小骨軟骨柱，直徑約4.0mm，長度約5.0mm，分別鑲嵌移植于缺損鉆孔處，與所鉆孔徑及深度相匹配，保證牢固嵌合，并著重注意保持移植后關節(jié)面平整，無明顯凹凸。縫合關節(jié)囊及滑膜，關閉切口。

1.2.3 同種異體骨軟骨移植 異體移植組隨機將該組動物骨軟骨柱對換移植，具體手術方法同自體移植組。

1.2.4 術后處理 兩組動物術后均肌注青霉素16萬單位，1天1次，共用藥1周，預防感染。未用免疫抑制劑，飲食條件相同。不限制運動，于術后第2周開始自由活動，于開闊環(huán)境中飼養(yǎng)，人為促進運動每天半小時。

1.2.5 觀察方法 各組動物于術后12周處死，取股骨髁關節(jié)面骨軟骨移植處為標本。①大體觀察:實驗動物跛行程度和恢復情況，關節(jié)活動度(固定髖關節(jié)，距膝關節(jié)遠側相等距離懸掛同等重量砝碼，測量膝關節(jié)活動度)，關節(jié)內有無粘連，修復組織表面的平整光滑程度、有無凹陷，顏色、質地、移植物充填程度、與周圍健康軟骨組織連接情況，軟骨退變情況，髕骨溝輪廓恢復情況。②組織學光鏡檢查:用0.1%的甲醛溶液固定缺損修復區(qū)及部分周邊正常軟骨，將標本以甲酸乙醇液脫鈣1周，分別做蘇木精—伊紅染色和Masson染色切片，觀察優(yōu)勢新生組織的性質、表面特性、與正常軟骨連接等組織學特性等。組織學評分:將標本蠟塊包埋、切片，行HE染色和甲苯胺藍染色，按照Wakitani法評分標準的組織學結果評分表進行評分。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包處理，采用完全隨機設計的單因素方差分析。

2 結果

2.1 活體觀察 術后1周，全部動物活動減少，跋行，雙膝略腫脹;1周后漸輕，稍有跋行。以后11周中采用改良的Clakeweeknesser檢查標準(固定髓關節(jié)，距膝關節(jié)遠側相等距離懸掛同等重量砝碼，測量膝關節(jié)活動度)測量動物關節(jié)伸屈活動范圍，可見術后12周，自體骨軟骨移植組膝關節(jié)活動度均優(yōu)于同種異體移植骨軟骨組(P＜0.01)，見表1。

2.2 標本大體觀察 ①自體骨軟骨移植組:關節(jié)腔無粘連，無積液，關節(jié)液淡黃色，關節(jié)內無退變增生。關節(jié)面顏色呈乳白色，和周圍軟骨面無明顯差異，表面光滑平整，與周圍正常軟骨融合良好。②異體骨軟骨移植組:關節(jié)囊有少許攣縮，質硬，關節(jié)內纖維束帶與關節(jié)表面充填組織有少許粘連，移植骨軟骨柱與受區(qū)融合，界限模糊。移植的軟骨面萎縮變薄，少數有軟骨面破損，關節(jié)面不平，色灰暗，標本軟骨面整個被包裹在纖維組織與炎性組織中，股骨的髕骨關節(jié)溝輪廓不清，退變增生嚴重。

表1 兩組膝關節(jié)伸屈活動范圍比較±s)度

表1 兩組膝關節(jié)伸屈活動范圍比較±s)度

組 別 n/只 術后4周 術后8周 術后12周8 45.15±2.15 57.51±3.92 68.35±3.75異體骨軟骨移植組 8 44.76±2.48 48.21±2.51 52.97±3.53 P自體骨軟骨移植組＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 組織學光鏡觀察 ①自體移植組:骨組織與受區(qū)骨性愈合，關節(jié)軟骨的厚度與受區(qū)正常軟骨基本一致，軟骨為透明軟骨特性，透明軟骨細胞排列規(guī)律，可見軟骨陷窩，潮線清楚，表面平整無退變。②同種異體骨軟骨移植組:移植物軟骨下板層、骨髓松質骨與宿主基本連接愈合，但松質骨小梁周圍尚未完全骨化。新生的關節(jié)軟骨細胞幼稚占多數。交界處淋巴細胞、漿細胞和多核白細胞浸潤減少。無移植的其他缺損區(qū)無軟骨形成。

2.4 組織學評分 按照Wakitani法評分標準的組織學結果評分表進行評分，設5項觀察指標:細胞形態(tài)學、基質染色(異染性)、表面規(guī)則性、軟骨厚度、與周圍軟骨整合度。其中，細胞形態(tài)學評分為:透明軟骨0、透明軟骨為主1、纖維軟骨為主2、少量軟骨3、無軟骨4;基質染色(異染性)評分為:正常0，輕度減少1，明顯減少2，無異染性顏色3;表面規(guī)則性評分為:光滑0，中等1，不規(guī)則2，極度不規(guī)則3;軟骨厚度評分為:＞2/3為0，1/3～2/3為1，＜1/3為2;周圍軟骨整合度評分為:邊緣完全整合為0，一側邊緣整合為1，未整合為2。

術后12周，按照Wakitani法評分標準自體骨軟骨移植較新鮮異體骨軟骨移植在細胞形態(tài)、基質染色、表面平整、軟骨厚度、周圍接合及總分方面，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。見表2。

3 討論

關節(jié)軟骨損傷后自身修復能力十分有限，較大面積的缺損無法自行修復。臨床上應用的方法主要有:①微骨折技術:通過穿透軟骨下骨板，使包含骨髓多能間充質干細胞的血凝塊聚集在軟骨缺損區(qū)的表面，形成含有Ⅱ型膠原的纖維軟骨覆蓋缺損區(qū)。該技術操作簡單易行、成本低下，常被用作首選的治療方案。綜合各方面的文獻資料［3～5］，該方法適用于軟骨缺損面積小于1cm2的患者。②骨軟骨的嵌鑲移植術:自體骨軟骨移植的方法是通過關節(jié)邊緣非負重區(qū)作為供區(qū)，選擇軟骨厚度適宜的部位，獲取一定數量、大小及長度的骨軟骨柱作為移植物，待處理好受區(qū)后予以植入，不需固定。該方法完好地保持了關節(jié)軟骨和骨床的緊密連接，具有取材方便，植入穩(wěn)定，愈合成活率高及關節(jié)軟骨修復能力強等優(yōu)點，而且可以在關節(jié)鏡下完成手術。近幾年在國內已先后開展該手術，臨床報道效果良好。而同種異體骨軟骨嵌鑲移植的效果卻報道不一，未在臨床上開展。

表2 兩組移植面組織學評分比較(±s)

表2 兩組移植面組織學評分比較(±s)

只 細胞形態(tài) 基質染色 表面平整 軟骨厚度 周圍接合 總分自體骨軟骨移植組 16 0.13±0.34 0.38±0.50 0.25±0.45 0.25±0.45 0組 別 n/.38±0.50 1.38±1.71異體骨軟骨移植組 16 2.88±0.62 2.13±0.34 2.25±0.45 1.88±0.34 1.88±0.34 11.00±4.04 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

目前的實驗研究主要集中在兩個方面:①組織移植:主要有自體或異體的骨軟骨、軟骨、骨膜等。②細胞移植:主要有自體或異體富集骨髓干細胞松質骨的腦胎軟骨細胞、軟骨膜細胞、骨髓干細胞、轉基因細胞及與載體一起在體外培養(yǎng)構建的工程軟骨等。

組織工程化關節(jié)軟骨的研究近幾年不斷增加，研究主要集中在軟骨組織工程載體、種子細胞和生物調控因子等方面。載體材料包括天然和人工合成可降解的復合物。天然材料主要有膠原、明膠、纖維蛋白和藻酸鹽等，存在的問題主要是力學性能差，極易為活性酶降解，吸收過快。人工合成高分子聚合物具有良好的生物相容性，常用的有聚酸乳、聚羥基乙酸及其共聚物。種子細胞目前常用的有軟骨細胞、骨髓基質干細胞(BMSCs)和胚胎干細胞(ESs)。生物調控因子繁多，其中以骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的研究最多，現在采用基因重組技術已成功分離和克隆出近40種BMP，在體外誘導軟骨表型分化方面發(fā)揮了顯著的作用。國內學者以藻酸鹽、聚乳酸、骨基質明膠為載體，采用骨髓間充質干細胞或軟骨細胞修復兔軟骨損傷方面已取得一定的成果［6～8］。總體分析，該類方法操作復雜，用于臨床尚早。

本實驗探討同種異體骨軟骨用于修復負重區(qū)軟骨缺損的可行性。通過采用多種觀察指標比較了自體和同種異體骨軟骨移植兩種方法修復關節(jié)軟骨缺損的效果。實驗結果顯示，新鮮無處理的同種異體骨軟骨鑲嵌移植修復關節(jié)軟骨缺損不行，其排斥反應及吸收破壞嚴重，療效不確切，不建議使用。

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