接偉光，蔡柏巖,2，白 莉

（1.黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部，哈爾濱150086；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)重點實驗室，哈爾濱 150080）

AM真菌是自然界中普遍存在的一種寡營養(yǎng)活體微生物，能夠侵染80%以上的陸生植物根系[1-3]。AM真菌具有能夠提高植物對營養(yǎng)元素的吸收，促進植物生長，提高植物抗病性，增強植物對鹽堿和污染物毒害的耐性，增加作物產(chǎn)量和改善品質(zhì)等作用[4-6]。近年來，AM真菌在農(nóng)作物上的應(yīng)用已受到國內(nèi)外廣大學(xué)者的重視，有關(guān)AM真菌的接種效應(yīng)已在不同農(nóng)作物的研究中得到證實。

甜菜是我國重要的糖料作物之一，在我國已有上百年的栽培歷史，但長期以來甜菜在產(chǎn)質(zhì)量及抗病方面沒有突破性的研究進展，使我國的甜菜科研水平整體落后于發(fā)達國家[7,8]。目前，有關(guān)菌根方面的研究報道較多，但在甜菜方面的研究卻少有報道。本文將傳統(tǒng)形態(tài)分類鑒定方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，對甜菜根際土壤AM真菌進行鑒定及對AM真菌侵染甜菜根系情況進行分子檢測，旨在為進一步開展甜菜AM真菌的基礎(chǔ)研究及AM真菌在甜菜上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2008年7月30日從哈爾濱工業(yè)大學(xué)糖業(yè)研究所試驗田隨機選取10株長勢良好的甜菜，每株作為1個樣地，每個樣地按東西南北4個方位，去除表層5cm厚的雜物，采集10～20cm土層土樣約1kg，同時收集其中的甜菜根系。將10個樣地采集的甜菜根系及根圍土壤分別充分混勻，各自組成1個混合樣品，土樣于陰涼處自然風(fēng)干后，置于陰涼處保存?zhèn)溆?。根樣帶回實驗室洗凈后，立即提取DNA后，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 AM真菌孢子形態(tài)鑒定 采用濕篩傾析-蔗糖離心法[9]分離甜菜根圍土壤AM真菌孢子，于解剖鏡下觀察其顏色并測定孢子大小、孢壁層次和厚度等，并初步分類。

1.2.2 AM真菌單孢DNA的提取 依據(jù)蔡柏巖等[10]描述的方法稍加修改，吸取單個AM真菌孢子，至少用無菌水漂洗5次，將其放入無菌的1.5mL離心管中，加入40μL TE緩沖液（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8.0），將其充分破碎后，加入 15μL 20%Chelex-100。 沸水浴 10min，冰浴 5min，15000r/min 離心 5min，吸取上清液到新的離心管中，置于-80℃保存，備用。

1.2.3 Nested-PCR 將上述AM真菌單孢DNA作為第一次PCR擴增模板，第一次PCR擴增產(chǎn)物100倍稀釋后作為第二次PCR擴增模板，進行Nested-PCR。引物序列（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。

第一次 PCR 擴增， 反應(yīng)體系為 20μL：10×PCR 緩沖液 2μL，2.5mmol/L dNTP 1.6μL，25mmol/L MgCl22μL，1.0μmol/L 的引 物 ITS1 和 NDL22 各 2μL，5 U/μL Taq polymerase 0.2μL， 模板 DNA 2.0μL，ddH2O 8.2μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性 3min；93℃變性 1min，55℃退火 1min，72℃延伸 1min，30個循環(huán)，最后 72℃延伸5min。第二次PCR擴增，反應(yīng)體系僅將引物對改為LR1-NDL22。反應(yīng)程序僅將退火溫度改為53℃。取兩次PCR擴增產(chǎn)物各5μL，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 Nested-PCR引物

1.2.4 目標(biāo)DNA片段的測序及系統(tǒng)發(fā)育分析 將陽性克隆產(chǎn)物與pGM-T（TIANGEN公司）載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，檢測重組子，將陽性克隆菌測序。測序結(jié)果提交至GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫，將擴增序列與GenBank中近緣種的序列進行缺省參數(shù)的對位排列（alignment），并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 AM真菌侵染甜菜根系檢測 根據(jù)測序結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，設(shè)計相應(yīng)AM真菌種特異性引物，檢測AM真菌侵染甜菜根系情況。

提取根樣DNA，方法同AM真菌單孢DNA的提取。第一次PCR擴增，反應(yīng)體系及程序同AM真菌單孢DNA Nested-PCR中的第二次PCR；第二次PCR擴增，反應(yīng)體系僅將第一次PCR擴增中使用的真核生物通用引物對改為AM真菌種特異性引物對。反應(yīng)程序僅將退火溫度改為58℃。分別取兩次PCR擴增產(chǎn)物各5μL，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將擴增產(chǎn)物進行測序，并進行blast分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AM真菌孢子形態(tài)特征

從甜菜根圍土壤中分離出大量AM真菌孢子，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，均為摩西球囊霉Glomus mosseae（T.H.Nicolson&Gerd.）Gerd.&Trappe,Mycologia Memoir,5:76,1974。其形態(tài)特征如下：孢子在土壤中單生、根內(nèi)生或孢子果內(nèi)形成；圓形，近圓形，直徑180～210μm，淡黃色至黃褐色；孢壁3層，L1和L2無色透明，L3淺黃至黃褐色。連孢菌絲單根，連點漏斗狀。標(biāo)本號：DFAM。標(biāo)本保存于黑龍江東方學(xué)院微生物學(xué)實驗室。

2.2 AM真菌單孢DNA Nested-PCR

由于AM真菌DNA的含量較低，經(jīng)第一次PCR擴增后，難以在瓊脂糖凝膠中觀察到相應(yīng)AM真菌的DNA帶型。經(jīng)擴增序列覆蓋核糖體25S rDNA中D1/D2可變區(qū)域的引物對LR1-NDL22進行第二次PCR擴增后，AM真菌相應(yīng)DNA序列被特異性地擴增出來，片段大小約為750bp（圖1）?？梢姡ㄟ^Nested-PCR的放大作用，能夠很好地將含量較低的靶模板DNA特異性擴增出來。

2.3 AM真菌25S rDNA D1/D2區(qū)測序及系統(tǒng)發(fā)育分析

測序結(jié)果表明，擴增的DNA序列全長為787bp，在GenBank中的登錄號為FJ790677。為顯示供試菌株與已知AM真菌之間的親緣關(guān)系及其系統(tǒng)地位，將測得序列在GenBank中進行同源序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖2）。菌株DFAM序列與數(shù)據(jù)庫中同源性較高的14個AM真菌進行比較，其25S rDNA D1/D2區(qū)序列與球囊霉屬Glomus的7個種和1個未培養(yǎng)真菌都有較高的序列同源性，其中與Glomus mosseae（DQ273793）的同源性最高，為98%。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，DFAM與Glomus mosseae能聚為一簇。綜合形態(tài)學(xué)特征及25S rDNA D1/D2區(qū)序列分析，將DFAM鑒定為摩西球囊霉G.mosseae。

2.4 甜菜菌根內(nèi)AM真菌的分子檢測

利用AM真菌種特異性引物5.25[13]：5′-ATCAACCTTTTGAGCTCG-3′與 引 物 NDL22配對，能夠特異性地檢測G.mosseae侵染甜菜根系情況。

第一次PCR擴增，結(jié)果與AM真菌單孢DNA的第一次PCR擴增結(jié)果類似，難以在瓊脂糖凝膠中觀察到大約750bp的AM真菌25S rDNA D1/D2區(qū)帶型。經(jīng)第二次PCR擴增后，檢測到編號為DFAM的相應(yīng)目的片段，約為370bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖3）。該目的片段經(jīng)測序及blast分析，證實為AM真菌特異性條帶，確定摩西球囊霉G.mosseae侵染甜菜根系。

3 討論

對侵染植物根系的AM真菌進行準(zhǔn)確鑒定是菌根研究的基礎(chǔ)，對于收集、保護及利用這類微生物資源具有重要的意義。目前，AM真菌的分子鑒定工作，國外已有研究報道，國內(nèi)開展得則很少[10,14]。本文應(yīng)用傳統(tǒng)AM真菌鑒定方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合對甜菜根圍AM真菌進行鑒定，能夠較全面、準(zhǔn)確地對其進行鑒定，同時提高了試驗結(jié)果的真實性。

由于AM真菌單孢和菌根中AM真菌DNA含量低，本試驗在提取DNA時使用了能夠整合多價金屬離子，尤其是選擇性整合二價離子的Chelex-100化學(xué)整合樹脂。該樹脂含有成對的亞氨基二乙酸鹽離子，比普通離子交換劑具有更高的金屬離子選擇性和較強的結(jié)合力，能結(jié)合許多可能影響一些分析的其他外源物質(zhì)。通過離心除去Chelex-100顆粒，使這些與Chelex-100結(jié)合的物質(zhì)與DNA分離，防止結(jié)合到Chelex-100中的抑制劑或雜質(zhì)帶到PCR反應(yīng)中，影響下一步的DNA分析，并通過結(jié)合金屬離子，防止DNA降解，保證了提取DNA的質(zhì)量。

本研究從甜菜根圍土壤中分離到G.mosseae，并且采用AM真菌種特異性引物，利用具有較高靈敏性的Nested-PCR技術(shù)對甜菜根系A(chǔ)M真菌DNA進行特異性擴增，檢測到目標(biāo)帶，證明G.mosseae侵染甜菜根系，為今后甜菜功能菌群及甜菜種植的進一步深入研究奠定了良好的基礎(chǔ)。同時，再次驗證了Nested-PCR技術(shù)對研究野外條件下的AM真菌生態(tài)學(xué)極為有益。

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