楊開杰

(邢臺廣播電視大學理工系,河北邢臺 054000)

Bt的活化時間對發(fā)酵周期的影響

楊開杰

(邢臺廣播電視大學理工系,河北邢臺 054000)

通過對蘇云金芽孢桿菌生長曲線的研究,將處于不同生長階段的菌體分別作為菌種,進行發(fā)酵實驗,對610 nm和278 nm波長處的吸光度變化曲線、溶氧變化曲線和p H值變化曲線進行比較,得出了菌種最佳的活化時間為8 h,把處于對數(shù)生長期的菌體作為“種子”,與未活化的菌種發(fā)酵相比,可以使發(fā)酵周期由32 h縮短為28 h。

蘇云金芽孢桿菌;發(fā)酵周期;活化時間

蘇云金芽孢桿菌(Bt)作為生物農(nóng)藥中的一種,以其獨特的優(yōu)勢成為目前產(chǎn)量最大、應用最廣的微生物殺蟲劑[1],占到生物農(nóng)藥的80%左右。目前,蘇云金芽孢桿菌的菌種選育、基因工程等上游技術逐漸走向成熟。而要滿足市場的大量需求,發(fā)酵生產(chǎn)是關鍵。

近年來,人們通過改變培養(yǎng)方式、發(fā)酵方法和設計新的反應器類型等方法來達到工業(yè)生產(chǎn)中高效發(fā)酵的目的[2],卻往往忽略了通過縮短發(fā)酵周期來提高發(fā)酵效率的方法。菌體的發(fā)酵周期除受培養(yǎng)基成分、發(fā)酵條件等影響外[3],菌種的活化時間也是影響發(fā)酵周期的關鍵因素。筆者系統(tǒng)研究了Bt菌種活化時間對發(fā)酵周期的影響,確定了最佳活化時間。

1 材料和方法

1.1 供試菌種

Bacillus thuringiensis HD-1。

1.2 儀器和設備

數(shù)顯光照培養(yǎng)箱,高壓滅菌鍋,SW-CJ-FD型凈化工作臺,光照恒溫振蕩培養(yǎng)箱,GBCS-8C型發(fā)酵罐,752C紫外-可見分光光度計。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 LB固體培養(yǎng)基

胰蛋白胨:10 g/L,北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠提供;酵母膏:5 g/L,北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠提供;NaCl:10 g/L,北京益利化學品公司提供;瓊脂:15 g/L,北京化學試劑公司提供;p H值為7.2～7.3。

1.3.2 自制培養(yǎng)基

玉米粉:15 g/L;豆餅粉:15 g/L;花生餅粉:12 g/L,購于市場;魚粉:5 g/L,北京飼料公司提供;淀粉:10 g/L,北京市恒利公司提供;K2HPO4:5 g/L,北京紅星化工廠提供;CaCO3:7 g/L,北京化學試劑公司提供;p H值為7.2～7.4。

1.4 菌種制備

采用LB固體培養(yǎng)基配方發(fā)酵 HD-1菌株,接種后36 h,向固體培養(yǎng)基上加入一定體積的無菌水,用手振蕩錐形瓶或用接種環(huán)輕輕刮拭瓊脂表面以洗落固體培養(yǎng)基表面的菌體,將菌懸液收集到一錐形瓶中,配置成菌懸液,冷凍保藏,備用。

1.5 菌體生長曲線確定

250 m L搖瓶,培養(yǎng)基裝量50 m L,共15瓶,滅菌后用其中14瓶接種,另外一瓶為空白。培養(yǎng)條件:30℃恒溫光照培養(yǎng),240 r/min搖床上振蕩培養(yǎng),每隔1 h在610 nm處測定吸光度,得到菌體生長曲線。

1.6 發(fā)酵罐試驗

分別將等體積的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌懸液、等體積菌懸液接種自制培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h和培養(yǎng)13 h的菌體,接種于發(fā)酵罐中發(fā)酵,每隔2 h取樣,分別在278 nm和610 nm處測發(fā)酵液吸光度,比較發(fā)酵效果。

1.7 參數(shù)測定方法

1.7.1 吸光度變化曲線測定

利用發(fā)酵罐中取樣針每隔2 h取樣一次,取樣發(fā)酵液1 mL,用去離子水稀釋100倍,測其在278 nm和610 nm處的吸光度值,每種測5次取平均值,求出目標產(chǎn)物的吸光度值并記錄。

1.7.2 溶氧量變化曲線

采用Mettler Toledo InPro 6000型溶氧電極在線檢測。

1.7.3 p H值變化曲線

采用M ettler To ledo InPro 3030型p H玻璃電極在線檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌體生長曲線

為確定Bt所處遲緩期、對數(shù)生長期和穩(wěn)定期等生長時期的具體時間,制作了Bt的生長曲線,見圖1。

可以看出,菌體在0～4 h生長非常緩慢,稱之為遲緩期,這主要是菌體適應新培養(yǎng)基環(huán)境以及自身的萌發(fā)所需要的時間;在5～10 h吸光度值迅速增加,這說明菌體總數(shù)迅速增加,成對數(shù)增長趨勢,稱之為對數(shù)期;10 h以后,吸光度變化已經(jīng)不明顯,這說明菌體數(shù)增加維持穩(wěn)定。

工業(yè)上發(fā)酵周期是一個關鍵因素,如何降低發(fā)酵周期直接影響到發(fā)酵的效益。在工業(yè)發(fā)酵中,遲緩期會增加生產(chǎn)周期而產(chǎn)生不利的影響。因此,可以利用對數(shù)期的細胞作為“種子”,接種前后所使用的培養(yǎng)基組分不要相差太大,以避免適應新培養(yǎng)基環(huán)境所需時間,從而縮短發(fā)酵周期。

2.2 610 nm處吸光度曲線比較

對于Bt菌來說,在610 nm處吸光度最大,因此用發(fā)酵液610 nm處吸光度變化曲線來表征菌體生長變化曲線。對于3種不同活化時間的菌種,接種后發(fā)酵液在610 nm處的吸光度變化曲線如圖2所示,測量方法見1.7.1。

圖1 Bt菌體生長曲線Fig.1 Grow th curves of bacillus thuringiensis

可以看出,對于用未活化的菌體作為菌種發(fā)酵時,在接種6 h時間內(nèi),吸光度變化比較緩慢,說明在此階段還沒有大量繁殖,處于群體生長規(guī)律中的遲緩期。這是由于把固體培養(yǎng)的菌體直接作為菌種,接種前后培養(yǎng)基成分差別較大,芽孢需要適應新環(huán)境,暫時缺少足夠的能量和必需的生長因子,導致了遲緩期的形成。隨后進入生長的對數(shù)期,此階段大概持續(xù)了10 h,對數(shù)期持續(xù)時間越長,對發(fā)酵越有利。在16～32 h進入穩(wěn)定期,隨后進入衰亡期。活化8 h菌種發(fā)酵相對于未活化的菌種發(fā)酵來說,遲緩期明顯縮短或不存在,這主要是因為菌種已在相同成分的培養(yǎng)基中得到活化,已經(jīng)到達了對數(shù)生長階段,接種于發(fā)酵罐后前后培養(yǎng)基成分無明顯差別,使菌體不需要重新適應環(huán)境,可以使對數(shù)生長得到繼續(xù)。從活化8 h的菌種發(fā)酵中可以看出,在4～14 h處于對數(shù)生長期,14～30 h處于穩(wěn)定生長期。菌種經(jīng)過活化13 h后菌體已處于生長的穩(wěn)定期,此時接種于發(fā)酵罐中,與活化8 h的菌種發(fā)酵相比較,610 nm處吸光度曲線除初始吸光度稍有增加外,無明顯變化。

從以上分析可以看出,將在相同培養(yǎng)基成分中活化8 h的菌體作為菌種,可使Bt的遲緩期時間縮短4 h左右,而菌體穩(wěn)定期持續(xù)的時間無明顯變化。

2.3 278 nm處吸光度曲線比較

圖2 活化時間對發(fā)酵液610 nm處吸光度的影響Fig.2 Effect of the activated time on abso rbency at 610 nm

經(jīng)測量,目標產(chǎn)物(伴胞晶體和芽孢混合物)在278 nm處吸光度最大,因此發(fā)酵液在278 nm處吸光度變化曲線可以表征目標產(chǎn)物的變化曲線。對于3種不同活化時間的菌種,接種后發(fā)酵液在278 nm處的吸光度變化曲線如圖3所示,測量方法見1.7.1。

未經(jīng)活化的菌種發(fā)酵時,發(fā)酵液在278 nm處的吸光度在前10 h變化不明顯,說明目標產(chǎn)物還未大量形成、釋放。隨著菌體的大量繁殖,進入生長對數(shù)期,此階段吸光度開始增加,表明伴孢晶體和芽孢開始大量形成并釋放。隨后菌體生長進入穩(wěn)定期,但目標產(chǎn)物的吸光度仍然增加,說明芽孢囊仍然不斷破裂,釋放出伴孢晶體,伴孢晶體的總量不斷增加。在36 h處達到最大值,相對穩(wěn)定5 h后,吸光度開始下降。而經(jīng)活化8 h的菌種接種,在發(fā)酵32 h后發(fā)酵液278 nm處吸光度達到最大值,相對未活化的菌體作為菌種來說,吸光度提前4 h達到最大值。從圖3可以看出活化8 h和活化13 h的菌體作為菌種發(fā)酵時,發(fā)酵液在278 nm處的吸光度曲線無明顯變化。這說明并不是活化時間越長,目標產(chǎn)物的量越多,這與菌種所處的生長階段有關。

從上面比較中看出,未活化菌種接種和經(jīng)活化的菌體接種培養(yǎng),目標產(chǎn)物達到最大值的時間前者比后者提前4 h,這主要是由于經(jīng)活化8 h的菌種使生長的遲緩期縮短或消失所造成的。

2.4 溶氧量變化曲線比較

對于3種不同活化時間的菌種接種后,發(fā)酵過程中發(fā)酵液溶氧量變化曲線見圖4,測量方法見1.7.2。

溶氧曲線從側(cè)面也能反應出菌體的生長過程,菌體生長越快,所需氧氣量越大,發(fā)酵液中的溶氧量就越低。圖4中用未經(jīng)活化菌種發(fā)酵時,溶氧最低點出現(xiàn)在菌體生長15～20 h的對數(shù)期,說明此時菌體增長率最高、新陳代謝最活躍。活化8 h和活化13 h的菌種發(fā)酵時,溶氧量最低點都出現(xiàn)在12 h,說明其最快增長期比用未活化的菌種發(fā)酵提前3 h。針對出現(xiàn)溶氧最低點的時刻,生產(chǎn)中可以在溶氧最低點時刻提高供氧量和補料,從而延長菌體的對數(shù)生長期或出現(xiàn)第2對數(shù)期,達到高效發(fā)酵的目的。

圖3 活化時間對發(fā)酵液278 nm處吸光度的影響Fig.3 Effect of the activated time on absorbency at 278 nm

2.5 p H值變化曲線比較

對于3種不同活化時間的菌種,接種后發(fā)酵液p H值的變化曲線如圖5所示,測量方法見1.7.3。

發(fā)酵過程中隨著代謝產(chǎn)物的積累,會使發(fā)酵液環(huán)境發(fā)生變化,使芽孢和晶體蛋白的形成受到影響,尤其是對p H值的影響,當p H值大于8時不利于伴孢晶體的形成。由于發(fā)酵液中的葡萄糖經(jīng) EM P和PP途徑降解成醋酸和丙酮酸,導致p H值下降,隨著醋酸等被進一步異化,p H值逐漸回升。在圖5中以未活化的菌種接種,在發(fā)酵42 h后p H值到達8.0,由于p H值的影響伴孢晶體總量開始下降。從圖3中也可以看出,278 nm處的吸光度在增加到一定程度后會出現(xiàn)5～6 h的相對穩(wěn)定期,由于p H值增大的影響,穩(wěn)定期過后吸光度值開始下降,因此把到達相對穩(wěn)定期初始點所需時間作為發(fā)酵周期,而不把278 nm處吸光度開始下降處作為結(jié)束的標志。

綜上,將3種不同活化時間菌種發(fā)酵的各參數(shù)最大(小)值及到達最大(小)值處的時間進行統(tǒng)計,見表1。從表1中可以看出,菌種的不同培養(yǎng)時間直接影響發(fā)酵的過程和周期。用未活化的菌體直接接種固體培養(yǎng)和用經(jīng)過活化8 h的菌體作為菌種接種時,菌數(shù)(610 nm處吸光度)和目標產(chǎn)物(278 nm處吸光度)到達最大值時前者要比后者晚4 h,而菌體活化8 h和活化13 h后接種出現(xiàn)最大值處的時間沒有明顯變化。因此比較可知,菌體活化8 h后接種為最佳的活化時間,這樣可使發(fā)酵周期提前4 h,而所獲得的目標產(chǎn)物的量基本不變。

表1 發(fā)酵液的吸光度和溶氧Tab.1 Absorbency and DO of ferment liquids

3 結(jié) 語

利用處于對數(shù)期的菌體作為“種子”,并且盡量使接種前后所使用的培養(yǎng)基組分不要相差太大,能夠使Bt的發(fā)酵周期縮短4 h(由原來的32 h縮短為28 h),從而提高生產(chǎn)效率。

[1]YASUHISA K.Current status and p rospects on microbial control in Japan[J].Journal of Invertebrate Pathology,2007,95:181-186.

[2]孫翠霞,弓愛君,姚偉芳,等.蘇云金芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].化學與生物工程(Chem istry and Bioengineering),2006,23(8):34-36.

[3]姚偉芳,弓愛君,宋小春,等.Bt固態(tài)發(fā)酵條件的研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)藥(Modern Agrochemicals),2006,5(3):4-6.

Effect of activated time of Bt on ferment cycle

YANG Kai-jie
(Polytechnic Department,Xingtai University of Broadcast and Television,Xingtai Hebei 054000,China)

By studying the grow th curve of bacillus thuringiensis,the experiment takes Bton various grow th phases as"seeds"to ferment,then the curves of abso rbency in 610 nm and 278 nm,dissolved oxygen and p H value are obtained.By comparing the curves,the best phase of Bt"seeds"is on the log phase.In comparison w ith unactivated Bt,the ferment cycle decreases from 32 h to 28 h.

bacillus thuringiensis(Bt);ferment cycle;activated time

Q 936

A

1008-1542(2010)06-0534-04

2010-07-07;

2010-09-16;責任編輯:張士瑩

楊開杰(1964-),男,河北邢臺人,講師,主要從事生物農(nóng)藥方面的研究。