杜密英蘇 琦杜進(jìn)民

（1桂林旅游高等?？茖W(xué)校，桂林 541006） （2河北廊坊工商局，廊坊065000） （3河北科技大學(xué)，石家莊 050018）

綠色木霉發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的培養(yǎng)條件研究

杜密英1*蘇 琦2杜進(jìn)民3

（1桂林旅游高等專科學(xué)校，桂林 541006） （2河北廊坊工商局，廊坊065000） （3河北科技大學(xué)，石家莊 050018）

以玉米芯為主要原料，探索綠色木霉發(fā)酵玉米芯產(chǎn)木聚糖酶的培養(yǎng)條件，進(jìn)一步提高木聚糖酶的酶活。結(jié)果表明其產(chǎn)酶最佳培養(yǎng)條件為：接種量為5 mL（孢子1.3×107個/mL），初始pH值為6，玉米芯與水質(zhì)量比為1∶2，溫度為33℃，在培養(yǎng)到第4 d時，其酶活力最高達(dá)1 537.52 U/mL。

綠色木霉；木聚糖酶；培養(yǎng)條件

木聚糖酶是一類重要的木糖苷鍵水解酶，對水解植物中的半纖維素有著重要的作用，特別是利用木聚糖酶酶解可制得雙歧桿菌增殖因子低聚木糖，國際上對木聚糖酶的研究十分重視。以木聚糖為碳源從而有選擇性地生產(chǎn)木聚糖酶在木霉屬和曲霉屬微生物已經(jīng)獲得了成功。玉米芯含有豐富的木聚糖，疏松適度利于通氣，表面積大，特別適合于好氣性微生物生長。本文以玉米芯為原料，摸索了綠色木霉最適產(chǎn)酶條件，可大大提高綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶的酶活。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米芯采集于河北省石家莊市近郊；綠色木霉菌種由河北科技大學(xué)生物安全實驗室提供。

1.2 化學(xué)試劑和儀器

1.2.1 DNS試劑的配制

A液：182 g酒石酸鉀鈉完全溶于500 mL蒸餾水中；B液：16 g氫氧化鈉完全溶于250 mL蒸餾水中；C液：10 g 3，5-二硝基水楊酸完全溶于B溶液中；DNS試劑：將C液與A液混合，加入5 g苯酚，溶解后用蒸餾水定容至1 000 mL，用棕色瓶放置7 d，用細(xì)紗布過濾，避光保存。

1.2.2 Tris-HCl緩沖液的配制

0.1 mol/L鹽酸溶液的配制：量取1 mL濃鹽酸，加蒸餾水定容至100 mL；0.1 mol/L Tris溶液的配制：稱取12.114 g Tris，加蒸餾水定容至1 000 mL；Tris-HCl緩沖液的配制：50 mL 0.1 mol/L Tris溶液，加入40.3 mL 0.1 mol/L HCl溶液，加蒸餾水定容至100 mL。

1.2.3 儀器

VIS-7220可見分光光度計，北京第二光學(xué)儀器廠；LRH-150S恒溫恒濕培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；LRH-300-GSⅡ微電腦控制人工氣候箱，廣東省醫(yī)療器械廠；D-1自動蒸汽滅菌鍋，北京海淀儀器廠；A250生化培養(yǎng)箱，江蘇省金壇市宏華儀器廠。

1.3 綠色木霉的培養(yǎng)

篩選培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、蛋白胨1 g、瓊脂22 g、濾紙10 g、自然pH值、1 000 mL蒸餾水，滅菌冷卻到50℃后加入1 mL鏈霉素（50萬單位/mL）。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、蛋白胨1 g、瓊脂22 g、濾紙10 g、自然pH值、1 000 mL蒸餾水，滅菌冷卻。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米芯10 g、磷酸二氫鉀0.16 g、硫酸銨0.1 g、豆餅粉0.15 g、蒸餾水100 mL，滅菌冷卻。

將少量土樣用蒸餾水溶解，取2 mL加到篩選培養(yǎng)基中，涂布均勻，置于33℃條件下培養(yǎng)4 d。挑取綠色的菌落，轉(zhuǎn)接到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，33℃繼續(xù)培養(yǎng)4 d。

發(fā)酵培養(yǎng)基接入5 mL孢子懸液，攪拌均勻，置于33℃條件下培養(yǎng)6 d。

1.4 制備方法

1.4.1 孢子懸液的制備

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的綠色木霉菌株為出發(fā)菌株，用無菌生理鹽水洗下平板上的孢子，置于50 mL的三角瓶中，33℃，振蕩30 min，用脫脂棉濾去菌絲片斷，血球計數(shù)板計數(shù)并調(diào)整孢子濃度為1.3×107個 /mL。

1.4.2 孢子濃度的檢測

采用血球計數(shù)板對孢子懸液進(jìn)行計數(shù)。

1.4.3 木聚糖酶粗酶液的制備

稱取發(fā)酵4d的發(fā)酵曲10g，用100mL 0.1mol/L（pH值5.0） 檸檬酸緩沖液于30℃的環(huán)境下浸提2 h，過濾，4 000 r/min離心10 min，取濾液，即為木聚糖酶粗酶液。

1.4.4 木聚糖液的制備

玉米芯粉20 g，自來水清洗3次～4次，用去離子水浸泡2 h，紗布過濾取渣，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%氫氧化鈉200 mL煮沸60 min，冷卻到室溫，用紗布過濾取濾液，用濃鹽酸中和到pH值為7，4 000 r/min離心10 min，沉淀干燥，得到粗木聚糖。稱取粗木聚糖5 g，100 mL去離子水溶解，得到粗木聚糖液。

1.5 測定方法

1.5.1 還原糖含量的測定

取木聚糖液0.5 mL，空白用去離子水，用Tris-HCl補至2.0 mL，加入DNS試劑1.5 mL，于沸水浴中加熱反應(yīng)5 min，冷卻，搖勻，過濾，取濾液，于540 nm處測吸光度，根據(jù)回歸方程求得還原糖的含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取干燥的木糖2.0 g，加去離子水溶解，定容至100 mL，此為標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液，質(zhì)量濃度為2 mg/mL。分別取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液，加到10 mL試管中。每個試管中加Tris-HCl補至2 mL，再各加DNS試劑1.5 mL，充分混勻后，于沸水浴中加熱反應(yīng)5 min，然后迅速用冷水將其冷卻至室溫，搖勻，于540 nm處測吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，木糖質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。注意，每個測定值都要有重復(fù)。每重新配置一次DNS，必須重新做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 還原糖-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5.2 木聚糖酶酶活的測定

木聚糖酶在一定條件下水解木聚糖，釋放出還原糖（以木糖計算） 與3,5-二硝基水楊酸（DNS）反應(yīng)，產(chǎn)生顏色變化，這種顏色變化與釋放的還原性糖（以木糖計算）的量成正比關(guān)系，即與酶樣品中的酶活性成正比。通過在540 nm的光吸收值查對標(biāo)準(zhǔn)曲線（以木糖為標(biāo)準(zhǔn)物）可以確定還原糖產(chǎn)生的量，從而確定出酶的活力單位。

參照參考文獻(xiàn)［5］G.L.Miller等的法具體操作如下：

取經(jīng)過適當(dāng)稀釋的粗酶液0.5 mL，加入2.0 mL木聚糖液，55℃條件下準(zhǔn)確反應(yīng)10 min之后，加入1.5 mL DNS試劑，充分混合均勻后，于沸水中煮沸5 min，取出，迅速用冷水將其冷卻至室溫，最后在540 nm吸光度下測定吸光度值，以空白對照調(diào)零。

空白對照：取經(jīng)100℃滅活適當(dāng)稀釋的粗酶液0.5 mL，加入2.0 mL木聚糖液，55℃條件下準(zhǔn)確反應(yīng)10 min后，加入1.5 mL DNS試劑，充分混勻后，于沸水中煮沸5 min，迅速用冷水將其冷卻至室溫，最后在540 nm下測定吸光度值。

酶活力單位定義為：試驗條件下每分鐘水解木聚糖形成相當(dāng)1 μg木糖的還原糖所需的酶量，計算公式如下：

式中：N——酶液稀釋倍數(shù)；

G——酶解溶液中木糖的含量，μg；

0.5——吸取的酶液體積，mL；

10——酶解時間，min。

1.6 綠色木霉發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶條件的優(yōu)化試驗

1.6.1 最適氮源的選擇

采用發(fā)酵培養(yǎng)基，其中的氮源分別為硫酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、玉米漿，經(jīng)高溫滅菌后，冷卻，將孢子懸液分別接種到4種培養(yǎng)基中，在33℃下培養(yǎng)6 d，然后測定木聚糖酶酶活。

1.6.2 最適接種量的選擇

采用發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量分別為3 mL、5 mL、10 mL、15 mL，在33℃下培養(yǎng)6 d，然后測定木聚糖酶酶活。

1.6.3 最適pH值的選擇

采用發(fā)酵培養(yǎng)基，其中的pH值分別為4、5、6、7，經(jīng)高溫滅菌后，冷卻，將孢子懸液分別接種到4種培養(yǎng)基中，在33℃下培養(yǎng)6 d，然后測定木聚糖酶酶活。

1.6.4 最適玉米芯與水質(zhì)量比的選擇

玉米芯與水按質(zhì)量比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4分別制成4種培養(yǎng)基，經(jīng)高溫滅菌后，冷卻，將孢子懸液分別接種到培養(yǎng)基中，在33℃下培養(yǎng)6 d，然后測定木聚糖酶酶活。

1.6.5 最適溫度的選擇

采用發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)高溫滅菌后，冷卻，將孢子懸液分別接種到培養(yǎng)基中，分別在23℃、28℃、33℃、38℃、43℃下培養(yǎng)6 d，然后測定木聚糖酶酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適氮源的選擇

豆餅粉作為綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶的氮源，含有促綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶的生長因子，而且便宜易得，因此在選擇氮源時，每種培養(yǎng)基中都添加豆餅粉。按照1.6.1的試驗條件進(jìn)行，每天測定綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶酶活。氮源對綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響如圖2所示。

圖2 氮源對綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響

從圖2可以看出：氮源對綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響較大。在4種氮源中，玉米漿促進(jìn)綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶的效果明顯高于其他的氮源，可能是因為玉米漿含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、氨基酸和多種維生素等，而這些物質(zhì)又是綠色木霉合成木聚糖酶所必需的，更有利于木聚糖酶的合成。當(dāng)培養(yǎng)到第4 d時，木聚糖酶酶活達(dá)到最高。隨著時間的延長，酶活降低，這可能是氮源逐漸減少，營養(yǎng)不足而不利于木聚糖酶的合成。

2.2 最適接種量的選擇

接種量的大小對微生物生長周期有一定的影響，不同的微生物因其生理特性不同以及不同的生長時期，接種量各不相同。本試驗選用3 mL、5 mL、10 mL、15 mL不同體積的孢子懸液（孢子的濃度為1.3×107個/mL） 接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以研究最適接種量。接種量對綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響如圖3所示。

從圖3可以看出：在培養(yǎng)過程中，酶活均呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，在培養(yǎng)4 d之后，均達(dá)到產(chǎn)酶高峰，并且此時5 mL接種量的酶活高于其他3種接種量，因此，以5 mL的接種量為最佳。接種量過低，菌體生長緩慢，發(fā)酵延遲，導(dǎo)致產(chǎn)酶量不高；接種量過高，發(fā)酵周期短，但是在生成大量酶的同時也受到代謝產(chǎn)物的阻遏作用，從而影響酶的產(chǎn)量。

圖3 接種量對綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響

2.3 最適pH值的選擇

培養(yǎng)基的初始pH值對木聚糖酶的合成有重要的影響，pH值不僅影響細(xì)胞膜所帶電荷，引起細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)吸收狀況變化，而且可以通過改變培養(yǎng)基中有機化合物分子進(jìn)入細(xì)胞狀況，而促進(jìn)或者抑制微生物的生長。因此，培養(yǎng)初期以及培養(yǎng)過程中pH值直接影響微生物的生長和酶的合成。另外，微生物往往能同時產(chǎn)生好多種酶，每一種微生物都有各自最適生長pH值和產(chǎn)酶pH值，可以通過調(diào)控培養(yǎng)初期以及培養(yǎng)過程的pH值，來選擇性合成某一種酶。Dokker研究認(rèn)為里氏木酶QM9414合成木聚糖酶的最適pH值為4～5。Poutanen認(rèn)為里氏木酶QM9414合成木聚糖酶的最適pH值為5.2，β-木糖苷酶的最適pH值為4.0。Bailoy等人在研究里氏木酶RutC-30合成木聚糖酶時發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過程中維持較高pH值能抑制維素酶的合成，提高木聚糖酶酶活和纖維素酶活的比值。劉超綱的研究也得到類似的結(jié)論。這對通過人工調(diào)控提高木霉選擇性合成木聚糖的能力具有指導(dǎo)意義。

本試驗通過改變發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值來研究pH值對綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響。調(diào)節(jié)pH值分別為4、5、6、7，培養(yǎng)6 d。pH值對綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響如圖4所示。

從圖4可以看出，培養(yǎng)基的初始pH值不同，綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶的酶活性明顯不同。在pH值達(dá)到6之前，隨著pH值的增大，木聚糖酶的酶活性逐漸升高；pH值為6時，木聚糖酶的酶活性最高，且在pH值5～6這個范圍內(nèi)，木聚糖酶的活性比較穩(wěn)定；pH值大于6之后，木聚糖酶酶活隨著pH值的增大而降低。因此培養(yǎng)基的初始pH值為6時，對于綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶是最有利的。究其原因，可能是pH值為6時，能夠有效地的影響細(xì)胞膜所帶的電荷，使培養(yǎng)基中的有機化合物分子很容易地進(jìn)入細(xì)胞，從而促進(jìn)細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，加快酶的合成。

圖4 pH值對綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響

2.4 最適玉米芯與水質(zhì)量比的選擇

固態(tài)發(fā)酵是指不溶性的底物在足夠的濕度但沒有游離水的狀態(tài)下被微生物所發(fā)酵的過程。在固態(tài)發(fā)酵的過程中，底物的含水量是一個非常重要的工藝參數(shù)。本試驗采用玉米芯為碳源，調(diào)整玉米芯與水質(zhì)量的比例分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，來研究玉米芯與水質(zhì)量比對綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響，結(jié)果如圖5。

圖5 玉米芯與水質(zhì)量比對綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響

圖5顯示，玉米芯與水質(zhì)量比為1∶2、培養(yǎng)4 d時的酶活最高，可能是培養(yǎng)基質(zhì)中適當(dāng)?shù)暮磕艽_保菌體良好的生長。含水量過低，不利于營養(yǎng)物質(zhì)溶解與傳遞，菌株孢子萌發(fā)緩慢，產(chǎn)酶量低；含水量過高，使培養(yǎng)基表面粘連，導(dǎo)致培養(yǎng)基中容氧量不足和發(fā)酵熱散失，而造成發(fā)酵不徹底。

2.5 最適溫度的選擇

溫度是發(fā)酵培養(yǎng)過程中重要的參數(shù)之一，控制好溫度可以減少其他酶的產(chǎn)生和分泌，提高木聚糖酶產(chǎn)量。據(jù)文獻(xiàn)［14］報道，微生物發(fā)酵最適菌體生長溫度與最適代謝產(chǎn)物合成溫度往往存在差異。因此，有必要選擇一個合適的發(fā)酵溫度以保證菌體生長與產(chǎn)物合成的順利進(jìn)行。本試驗研究了不同溫度對綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 溫度對綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響

圖6 溫度對綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響

圖6顯示，木聚糖酶酶活性的變化規(guī)律具有一般酶的共性。隨著溫度升高，木聚糖酶活性上升，峰值出現(xiàn)在33℃，此時木聚糖酶酶活達(dá)到1 537.52 U/mL；之后隨著溫度的升高，活性開始下降，到43℃，幾乎和23℃的酶活一致。當(dāng)培養(yǎng)溫度控制在33℃時，綠色木霉誘導(dǎo)合成木聚糖酶的水平較高，酶活達(dá)到1 537.52 U/mL，這與吳克等在木霉菌株T6木聚糖酶固態(tài)發(fā)酵條件和酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果有所不同。當(dāng)溫度低于28℃，不利于菌體生長，雜菌容易生長，易造成污染。當(dāng)溫度高于38℃，基質(zhì)容易變干，甚至出現(xiàn)燒曲的現(xiàn)象。

由圖6還可以看出，在氮源、玉米芯和水質(zhì)量比、pH值和溫度等培養(yǎng)條件都進(jìn)行優(yōu)化后，在第4 d酶活達(dá)到最高。這是因為固體培養(yǎng)基在高溫滅菌時，有部分多糖水解，所以發(fā)酵開始時，基質(zhì)中含有較高濃度的殘留還原糖，這為細(xì)胞的快速生長提供了可快速吸收的營養(yǎng)物質(zhì)。由于木聚糖酶系誘導(dǎo)酶，酶的合成會受到容易利用碳源的阻礙，加之發(fā)酵開始階段的生物量較少，所以酶活力較低，至發(fā)酵第4 d時，木聚糖酶活力達(dá)高峰。培養(yǎng)第5 d，酶活力下降，所以此菌株固體發(fā)酵以4 d為宜。

3 結(jié)論

優(yōu)化了綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶的培養(yǎng)條件，主要對于接種量、初始pH值、固液質(zhì)量比、溫度等條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，產(chǎn)酶最佳培養(yǎng)條件為：接種量為5 mL（孢子1.3×107個/mL），初始pH值為6，玉米芯與水質(zhì)量比為1∶2，溫度為33℃，在培養(yǎng)到第4 d時，其酶活力最高達(dá)1 537.52 U/mL。

［1］ 周秀梅.木聚糖酶生產(chǎn)及酶學(xué)性質(zhì)的研究［D］.浙江：浙江大學(xué)，2005：6-8.

［2］ 張強，馬齊，徐升運.木聚糖酶降解玉米秸稈的工藝研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（34）：14 848-14 850.

［3］ 李丹.黑曲霉木聚糖酶的發(fā)酵性質(zhì)及其應(yīng)用研究［D］.長春：東北師范大學(xué)，2004：20-21.

［4］ 付五兵，朱濤，張勤良.Bacillus suttilis產(chǎn)木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)及其在禽飼料中應(yīng)用的初步研究［J］.飼料工業(yè)，2005（16）：27-30.

［5］ G.L.MILLER.Use of dinitrosAlicylicacidreagent for determination of reducingsugar［J］.SnalChem，1959（31）：426.

［6］ 程海燕，張潔，吳克.產(chǎn)堿性木聚糖酶芽孢桿菌HIS的篩選及發(fā)酵條件研究［J］.工業(yè)微生物，2002，32（2）：30-32.

［7］ 楊燕凌.聚糖酶固體發(fā)酵條件的試驗［J］.河南科技大學(xué)學(xué)報，2005，26（5）：93-96.

［8］ R.F.H.DEKKER.Emhancement in cellulase production by trichoderma reesei RUT C-30 due to citric acid［J］.Biotechnol Bioeng，1983（25）：1 127-1 146.

［9］ P.KOUTANNEN.Effect of pH on production of xylanase by trichoderma reesei on xylan and cellulose based media［J］.Biotechnol，1987（6）：49-60.

［10］P.BIELEY.Hemicellulose and hemicellulase［M］.Lond：Portland Press，1993：29-51.

［11］劉超綱.里氏木霉木聚糖酶的選擇性合成及其應(yīng)用基礎(chǔ)研究.［D］.南京：南京林業(yè)大學(xué)，1999：87-92.

［12］ M.V.R.MURTHY.Biochemical Engineering Aspects of Solid-state Fermentation［J］.Advances in Applid Microb，1993（38）：99-147.

［13］吳克，劉斌，張潔.木霉T6木聚糖酶液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2000，27（3）：9-12.

［14］冉曉慧，顏景斌.變溫培養(yǎng)在林可霉素發(fā)酵上的應(yīng)用［J］.醫(yī)藥工程設(shè)計雜志，2003，24（5）：7-9.

［15］吳克，蔡敬民，劉斌.木霉菌株T6木聚糖酶固態(tài)發(fā)酵條件和酶學(xué)性質(zhì)研究 ［J］.菌物系統(tǒng)，2001，20（2）：191-195.

Effect ofculture conditions on xylanase activity produced from trichoderma

DUMi-ying1*SUQi2DUJin-min3
1（Guilin institute oftourism，Guilin 541006，China）2（Langfangbureau ofindustryand commerce，Langfang 065000，China）3（Hebei universityofscience and technology，Shijiazhuang 050018，China）

The cultivation conditions were discussed.The most suitable carbon source in the culture media should be corncob，the most suitable nitrogen source was the corn thick liquid，the quantity of the inoculation should be 5 mL（1.3×107spores/mL），the initial pH value is 6，the proportion of the solid and liquid wais 1∶2，the temperature was 33℃，the time was 96 h.In these conditions could the enzymatic activityreach to1537.52 U/mL.

trichoderma viride；xylanase；cultivation condition

TS261.1+5

A

1673-6004（2011）04-0056-04

* 杜密英，女，1978年出生，2007年畢業(yè)于河北科技大學(xué)食品科學(xué)專業(yè)，碩士，助教。

2011-10-11