李青，趙秀明，劉佳，趙征

（天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

酶法制備干酪風(fēng)味劑的研究

李青，趙秀明，劉佳，趙征

（天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

研究了利用商業(yè)酶制劑酶解新鮮凝塊制備干酪風(fēng)味劑的工藝。通過單因素實驗和正交實驗，確定了最佳酶解條件：蛋白酶添加量0.4%，調(diào)整初始pH值6.5，45℃下酶解4 h；脂肪酶添加量1.5%，35℃下攪拌酶解8 h，攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min。由此工藝制備的干酪風(fēng)味劑口感較好，但香氣強(qiáng)度稍差。利用GC-MS法對干酪風(fēng)味劑中主要揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行分析，共鑒定出26種風(fēng)味物質(zhì)，其中酸類物質(zhì)的總含量為35.07%；醛類、酮類和酯類物質(zhì)的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.47%。

干酪風(fēng)味劑；蛋白酶；脂肪酶

0 引 言

消費者對預(yù)制食品需求的擴(kuò)大，推動了低生產(chǎn)成本、高風(fēng)味強(qiáng)度干酪風(fēng)味劑的發(fā)展，并已將干酪風(fēng)味劑廣泛應(yīng)用于各種終產(chǎn)品中[1]。

濃縮干酪風(fēng)味劑是干酪風(fēng)味配料的一種，以酶改性干酪（EMC）為代表的干酪風(fēng)味劑，其基礎(chǔ)是在最優(yōu)條件下，向乳制品底物中添加不同的具有特異性的酶制劑，迅速生產(chǎn)出強(qiáng)烈的干酪風(fēng)味劑[2,3]。干酪風(fēng)味劑既可以用于再制干酪、再制干酪型產(chǎn)品或其他干酪中，以生產(chǎn)出具有特定風(fēng)味的不同干酪，也可以作為配料部分或完全代替成熟干酪添加到其他食品中，減少成熟干酪的使用量，從而降低產(chǎn)品的生產(chǎn)成本[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

自制新鮮凝塊 （制備方法采用Cheddar生產(chǎn)工藝），檸檬酸鈉（食品級），多聚磷酸鈉（食品級），焦磷酸鈉（食品級），脂肪酶Validase Lipase RO（酶活力單位為20000 U/g），蛋白酶Accelerzyme CPG（酶活力單位為32130 U/g），蛋白酶Flavourzyme 500MG（酶活力單位為28870 U/g）等。

1.2 儀器設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋，電動攪拌器，實驗室pH計，石墨消解儀，自動凱氏定氮儀，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀等。

1.3 方法

1.3.1 酶解底物的制備

將凝塊與水按1∶1比例混合，向其中加入定量的乳化鹽 （0.5%焦磷酸鈉+1.0%檸檬酸鈉+1.5%多聚磷酸鈉），于85℃水浴鍋中加熱攪拌15 min，以滅活凝乳酶和牛乳中存在的其他酶類。然后將酶解底物冷卻至45℃，待用。

1.3.2 感官評價方法

本研究的感官評價分為3個部分：第一部分是蛋白酶酶解后的酶解產(chǎn)物，對這部分的評價主要是口感；第二部分是脂酶酶解后的酶解產(chǎn)物，對這部分的評價主要是香氣[5]；第三部分是對最終產(chǎn)品干酪風(fēng)味漿料和天然成熟干酪進(jìn)行感官比較。評價小組由10人組成。本研究所設(shè)計的感官評價標(biāo)準(zhǔn)是以我國硬質(zhì)干酪標(biāo)準(zhǔn)QB/T3776-1999[6]為基礎(chǔ)的。

（1）蛋白酶酶解產(chǎn)物感官評價標(biāo)準(zhǔn)。采用百分制，對口感、滋味和氣味進(jìn)行評價。其中口感包括濃厚感（40分）、延伸感（30分）、和黏稠度（10分），滋味和氣味包括乳香味（15分）和苦味（5分）。

（2）脂肪酶酶解產(chǎn)物感官評價標(biāo)準(zhǔn)。采用百分制，對風(fēng)味和狀態(tài)進(jìn)行評價。其中風(fēng)味包括香氣強(qiáng)度（30分）、干酪香氣象征性（30分）和酸味（15分），狀態(tài)包括質(zhì)地和硬度（25分）。

（3）干酪風(fēng)味劑產(chǎn)品感官評價標(biāo)準(zhǔn)。采用百分制，對口感（20分）、香氣強(qiáng)度（30分）、象真性（30分）和整體協(xié)調(diào)性（20分）進(jìn)行評價。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

（1）樣品處理方法。取1.5 g干酪樣品，加等量的無水Na2SO4混合、碾碎至樣品混合物為粉狀，迅速將樣品裝入15mL的樣品瓶內(nèi)，并加入40 μg壬烷作為內(nèi)標(biāo)[7,8]，加蓋封口。在45℃水浴中平衡30 min，頂端插入PDMS/DVB萃取頭，于45℃水浴萃取30 min后，用GC-MS分析。

（2）色譜條件。分離柱為VF-5 ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm；進(jìn)樣口溫度為250℃；

載氣為He，純度99.999%；柱流速為1.0 mL/min。程序升溫：初始40℃，保持3 min，以4℃/min升至150℃，保持1 min；以8℃/min升至250℃，保持6 min。

（3）質(zhì)譜條件。傳輸線溫度為280℃，離子阱溫度為220℃。數(shù)據(jù)采集：全掃描，溶劑延遲時間1.5 min；掃描范圍為43～500 m/z。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶酶解單因素實驗

2.1.1 酶添加量對酶解效果的影響

利用蛋白酶Accelerzyme CPG和Flavourzyme 500MG（4∶1）對酶解底物進(jìn)行水解，在酶解溫度45℃，不控制pH值條件下，酶解4 h，以pH4.6-WSN和12%TCA-SN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，研究不同加酶量（0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%）對酶解效果的影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出，隨著酶添加量的增加，pH4.6-WSN和12%TCA-SN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增大后減小。當(dāng)加酶量為0.5%時，pH4.6-WSN和12%TCA-SN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大；當(dāng)加酶量超過0.5%時，pH4.6-WSN和12%TCA-SN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有下降。本研究選擇0.3%～0.5%為蛋白酶的添加范圍。

2.1.2 酶解時間對酶解效果的影響

在酶解溫度45℃，加酶量0.5%，不控制pH值條件下，以pH4.6-WSN和12%TCA-SN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，研究不同酶解時間（0，2，4，6，8，10 h）對酶解效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，在2 h前，隨著酶解時間的延長，pH4.6-WSN和12%TCA-SN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加較快，在4 h時，pH4.6-WSN和12%TCA-SN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大，之后整體呈下降趨勢，但趨勢緩慢。本研究選擇2～6 h為蛋白酶酶解時間范圍。

2.1.3 酶解溫度對酶解效果的影響

蛋白酶Accelerzyme CPG的最適溫度為35～50℃，蛋白酶Flavourzyme 500MG的最適溫度約為50℃。本研究結(jié)合兩種酶的最適溫度，在加酶量0.5%，不控制pH值條件下酶解4 h，以pH4.6-WSN和12%TCA-SN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，研究不同酶解溫度（35，40，45，50，55℃）對酶解效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，隨著溫度的升高，pH4.6-WSN和12%TCA-SN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增加后減少，當(dāng)溫度達(dá)到45℃時，pH4.6-WSN和12%TCA-SN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大；而當(dāng)溫度超過45℃時，pH4.6-WSN和12%TCA-SN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸減少，可能是由于溫度繼續(xù)升高，蛋白酶逐漸失活。因此，本研究選擇40～50℃為蛋白酶酶解溫度范圍。

2.1.4 pH值對酶解效果的影響

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%檸檬酸溶液和飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)酶解底物的初始pH值，在酶解過程中不再調(diào)整pH值。在酶解溫度45℃，加酶量0.5%的條件下酶解4 h，以pH4.6-WSN和12%TCA-SN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，研究不同初始pH值（6.0，6.5，7.0，7.5，8.0）對酶解效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，pH值為6.5時，pH4.6-WSN和12%TCA-SN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大，當(dāng)pH值大于6.5時，pH4.6-WSN和12%TCA-SN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸減小。因此，本研究選擇6.0～7.0為pH值范圍。

2.2 正交實驗優(yōu)化蛋白酶酶解工藝條件

選取加酶量、酶解時間、酶解溫度和底物初始pH值4個因素，通過L9（34）正交表進(jìn)行蛋白酶酶解優(yōu)化實驗。正交實驗設(shè)計如表1所示，結(jié)果如表2所示。

表1 蛋白酶酶解工藝條件優(yōu)化正交實驗

表2 蛋白酶酶解工藝的正交實驗結(jié)果

由表2可以看出，以pH4.6-WSN質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，影響蛋白酶酶解工藝條件的各因素的主次順序為D＞B＞A＞C，即pH值＞酶解時間＞加酶量＞酶解溫度，最優(yōu)水平組合為A2B2C2D2；以12%TCA-SN質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，影響蛋白酶酶解工藝條件的各因素的主次順序為 D＞A＞B＞C，即pH值＞加酶量＞酶解時間＞酶解溫度，最優(yōu)水平組合為A3B3C2D2。而感官得分最高的組合為A1B2C2D2。經(jīng)過驗證實驗，確定最佳工藝條件為A2B2C2D2，即加酶量0.4%，酶解時間4 h，酶解溫度45℃，pH值6.5。

2.3 脂肪酶酶解單因素實驗

按照蛋白酶酶解最佳工藝條件制備干酪漿，并于100℃加熱15 min，以使干酪漿中的殘余蛋白酶失活。然后添加脂肪酶進(jìn)行單因素試驗。

2.3.1 酶添加量對酶解效果的影響

在酶解溫度40℃，不控制pH值條件下，酶解4 h，以FFA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，結(jié)合感官評價，研究不同添加量 （0.6%，0.9%，1.2%，1.5%，1.8%） 對酶解效果的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可以看出，隨著脂酶添加量的增加，酶解產(chǎn)物中FFA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加，但當(dāng)添加量大于1.5%時，F(xiàn)FA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加緩慢。本研究選擇1.2%～1.8%為脂酶的添加范圍。

2.3.2 酶解時間對酶解效果的影響

在酶解溫度40℃，加酶量1.5%，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，不控制pH值條件下，以FFA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，研究不同酶解時間（0，2，4，6，8，10 h）對酶解效果的影響，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可以看出，隨著酶解時間的延長，酶解產(chǎn)物中FFA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加，但當(dāng)酶解時間超過6 h以后，F(xiàn)FA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加緩慢。本研究選擇4～8 h為酶解時間范圍。

2.3.3 酶解溫度對酶解效果的影響

在加酶量1.5%，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，不控制pH值條件下，酶解4 h，以FFA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，研究不同酶解溫度(30，35，40，45，50 ℃)對脂肪酶酶解效果的影響。

由圖7可以看出，隨著溫度的升高，F(xiàn)FA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢是先增加后減少，當(dāng)溫度達(dá)到40℃時，F(xiàn)FA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大；而當(dāng)溫度超過40℃時，F(xiàn)FA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸減少，說明溫度繼續(xù)升高，脂酶逐漸失活。本研究選擇35～45℃為酶解溫度范圍。

2.3.4 攪拌速度對酶解效果的影響

在酶解溫度40℃，加酶量1.5%，不控制pH值條件下，酶解4 h，以FFA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，結(jié)合感官評價，研究不同攪拌轉(zhuǎn)速(100，150，200，250，300 r/min)對脂肪酶酶解效果的影響，結(jié)果如圖8所示。

由圖8可以看出，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min時，酶解產(chǎn)物中FFA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大。本研究選擇150～250 r/min為攪拌轉(zhuǎn)速范圍。

2.4 正交實驗優(yōu)化脂肪酶酶解工藝條件

選取加酶量、酶解時間、酶解溫度和攪拌轉(zhuǎn)速4個因素，通過L9（34）正交表進(jìn)行脂肪酶酶解優(yōu)化實驗。正交實驗設(shè)計如表3所示，結(jié)果如表4所示。

表3 脂肪酶酶解工藝條件優(yōu)化正交實驗

表4 正交實驗結(jié)果

由表4可以看出，影響脂肪酶酶解工藝條件的各因素的主次順序為B＞C＞D＞A，即酶解時間＞酶解溫度＞攪拌轉(zhuǎn)速＞加酶量。以FFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)得到的最優(yōu)水平組合為A3B3C2D1，但在此條件下，酶解產(chǎn)物的感官得分為95，并不是最高。由于本研究的目的是要通過酶解的方式獲得風(fēng)味強(qiáng)烈、質(zhì)地細(xì)膩的干酪風(fēng)味劑。因此，感官評價在本研究中是重要的依據(jù)，根據(jù)感官評價的結(jié)果，結(jié)合FFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)。本研究選擇最佳的脂肪酶酶解工藝條件為A2B3C1D2，即加酶量1.5%，酶解時間8 h，酶解溫度35℃，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min。

2.5 干酪風(fēng)味劑與天然成熟干酪感官品質(zhì)的比較

表5為干酪風(fēng)味劑與天然成熟干酪感官評價的比較結(jié)果。

表5 感官評價的比較結(jié)果

由表5可以看出，干酪風(fēng)味劑在口感和整體協(xié)調(diào)性方面均優(yōu)于天然成熟干酪，在香氣強(qiáng)度和象真性方面略低于天然成熟干酪，說明干酪風(fēng)味劑雖然不如天然成熟干酪的香氣強(qiáng)烈，但是它的整體協(xié)調(diào)性較強(qiáng)，更容易被人們接受。

干酪風(fēng)味劑揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定結(jié)果如圖9和表6所示。

表6 干酪風(fēng)味劑中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

3 結(jié) 論

（1）經(jīng)過單因素試驗和正交試驗，確定蛋白酶酶解最佳工藝條件為加酶量為0.4%，調(diào)整初始pH值6.5，45℃下酶解4 h；脂肪酶酶解最佳工藝條件為加酶量1.5%，35℃下攪拌酶解8 h，攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min。

（2）通過感官評價比較了干酪風(fēng)味劑和天然成熟干酪在口感和香氣等方面的差異，說明干酪風(fēng)味劑的香氣雖然不夠強(qiáng)烈，但在口感和整體協(xié)調(diào)性方面更容易被人們接受。

（3）采用GC-MS法測定干酪風(fēng)味劑中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，共鑒定出26種相關(guān)風(fēng)味成分：烴類10種，醇類1種，酸類5種，酮類5種，醛類3種，酯類2種。

[1]KILCAWLEY K N,WILKINSON M G,FOX P F.A Novel Twostage Process for the Production of Enzyme-modified Cheese[J].Food Research International，2006，39（5）：619-627.

[2]PATRICK F F,PAUL L H M,TIMOTHY M C，et al.Cheese-Chemistry，Physics & Microbiology Vol.2 Major Cheese Groups[M].UK：Elsevier Applied Science，2004：419.

[3]WILKINSON M，KILCAWLEY K，MULHOLLAND E.Enzyme Modified Cheese Flavour Ingredients[R].Dublin：The Dairy Products Research Centre，1999.

[4]KILCAWLEY K N,WILKINSON M G,FOX P F.A Novel Twostage Process for the Production of Enzyme-modified Cheese[J].Food Research International，2006，39（5）：619-627.

[5]鄧海燕.酶改性干酪及其產(chǎn)物微膠囊化的工藝研究[D].廣州：華南理工大學(xué)，2009.

[6]QB/T3776-1999.硬質(zhì)干酪[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1999.

[7]劉巖梅，張樹明，趙昌政.淺談食品風(fēng)味物質(zhì)的分離分析方法[J].中國食品添加劑，2004（3）：104-107.

[8]于鐵妹，王衛(wèi)飛.GC-MS分析天然奶味香精的致香成分[J].現(xiàn)代食品科技，2008，24（1）：80-82.

Study on cheese flavouring by enzymes

LI Qing,ZHAO Xiu-ming,LIU Jia,ZHAO Zheng
(College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China)

The method to generate cheese flavoring by using commercial enzyme preparations to hydrolyze fresh curds was studies.The optimal conditions of hydrolysis were determined through the single factor experiment and the orthogonal experiment:the protease level was 0.4%,adjust pH to 6.5,hydrolyze 4 h under 45℃;Lipase level was 1.5%,hydrolyze 8 h under 35℃,stirring speed was 200 r/min.The cheese flavoring manufactured from this process has better mouthfeel but lower flavour intensity.GC-MS method was used to analyze the volatile flavour compounds of cheese flavouring,26 kinds of flavor compounds were identified in total.The content of acid was 35.07%;the content of aldehydes,ketones and esters was 15.47%.

cheese flavoring；protease；lipase

TS252.53

A

1001-2230（2011）11-0024-05

2011-08-01

李青（1986-），女，碩士研究生，研究方向為乳品加工技術(shù)。

趙征