陶千山,羅 欣,柴 瑜,胡道軍,張勝權(quán)

(安徽醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,安徽 合肥 230032)

人白介素-15基因系列啟動(dòng)子克隆及其熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建

陶千山,羅 欣,柴 瑜,胡道軍,張勝權(quán)

(安徽醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,安徽 合肥 230032)

目的 克隆人白介素-15(IL-15)基因系列啟動(dòng)子,構(gòu)建 IL-15基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體。方法通過 PCR方法從 HaCaT細(xì)胞基因組DNA中獲得 IL-15基因編碼序列 5′上游七段逐步缺失的 IL-15啟動(dòng)子序列;雙酶切后,分別重組到含螢火蟲熒光素酶的報(bào)告基因 p GL3-Basic載體上,構(gòu)建 IL-15基因系列啟動(dòng)子報(bào)告基因載體;用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將含最長(zhǎng)啟動(dòng)子序列的報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染至 HaCaT細(xì)胞,并設(shè)置空白對(duì)照組和 LPS組分別處理;24 h后采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)其啟動(dòng)子活性。結(jié)果 經(jīng) PCR方法擴(kuò)增出七段逐步缺失的 IL-15基因啟動(dòng)子片段,PCR及雙酶切鑒定各重組體構(gòu)建正確;瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 HaCaT細(xì)胞后經(jīng)報(bào)告基因檢測(cè)得知所克隆最長(zhǎng)序列具有啟動(dòng)子活性。結(jié)論 成功構(gòu)建了 IL-15系列啟動(dòng)子報(bào)告基因載體,并在 HaCaT細(xì)胞中初步活性分析得知所克隆IL-15基因調(diào)控系列內(nèi)包含啟動(dòng)子核心區(qū)域,為進(jìn)一步研究 IL-15表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

IL-15;啟動(dòng)子;雙熒光素酶報(bào)告基因

人白介素-15(IL-15)是一種重要的可溶性細(xì)胞因子[1]。其基因位于 4q31,跨度約 34 kb,含 9個(gè)外顯子;成熟的 IL-15是一種糖蛋白,共 114個(gè)氨基酸殘基組成,為一種四α-螺旋束結(jié)構(gòu),含兩個(gè)二硫鍵及 C末端兩個(gè)糖基化位點(diǎn)[2]。多種細(xì)胞和組織均可表達(dá) IL-15,其中表達(dá)最高的是外周血單核細(xì)胞(PBMC)。IL-15表達(dá)異常與一些免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。

IL-15基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制復(fù)雜,其在多個(gè)表達(dá)水平受到多種因素的影響。目前的研究較集中于 IL-15基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯前水平,對(duì)于 IL-15基因上游調(diào)控序列的研究涉獵不多。為深入分析IL-15基因啟動(dòng)子的核心區(qū)域以進(jìn)一步明確其調(diào)控機(jī)制,我們克隆了 IL-15基因逐步缺失的系列啟動(dòng)子,構(gòu)建到報(bào)告基因載體 p GL3-Basic上并對(duì)其在人角質(zhì)形成細(xì)胞株 (HaCaT細(xì)胞)中的活性進(jìn)行了初步檢測(cè)。

1 材 料

p GL3-Basic質(zhì)粒、phRL-CMV質(zhì)粒、Dual luciferase reporter Kit、質(zhì)粒小量提取試劑盒,Promega公司;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清,GIBCO公司;Lipofectamine 2000,Invitrogen公司;細(xì)胞基因組提取試劑盒和凝膠回收試劑盒,Axygen公司;限制性內(nèi)切酶 KpnⅠ和 XhoⅠ,大連寶生物工程公司;Ex Taq DNA聚合酶和 T4 DNA連接酶,Takara公司;ModulusTM多功能光度計(jì),Turner BioSystems公司;HaCaT細(xì)胞和 E.coli JM 109菌株,本室凍存。

2 方 法

2.1 IL-15基因系列啟動(dòng)子的克隆

2.1.1 引物設(shè)計(jì) 從 http://genome.ucsc.edu/數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得 IL-15啟動(dòng)子序列,用 Primer Premier5.0分別設(shè)計(jì)七對(duì)啟動(dòng)子引物序列 (見表 1),并在上游引物 5′端加入 KpnⅠ的酶切位點(diǎn) CGGGGTACC,在下游引物 5′端加入 XhoⅠ的酶切位點(diǎn)CCGCTCGAG。

表 1 PCR引物序列表Tab.1 PCR primers′sequence table

2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及基因組提取 HaCaT細(xì)胞復(fù)蘇后用含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在 37℃,5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)至細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,以細(xì)胞基因組 DNA提取試劑盒提取其基因組 DNA。

2.1.3 啟動(dòng)子的克隆 以 HaCaT細(xì)胞基因組 DNA為模板 ,分別用 F0、F1、F2、F3、F4、F5、F6為上游引物、R為共同下游引物,經(jīng) 94℃變性 50 s,55℃退火50 s,72℃延伸 1～3 min不等,共 32個(gè)循環(huán),PCR擴(kuò)增獲得七段系列 IL-15基因啟動(dòng)子片段。然后用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定,再切下凝膠上的目的條帶用試劑盒回收純化。

2.2 IL-15系列啟動(dòng)子報(bào)告基因載體的構(gòu)建與鑒定

將上述克隆的系列啟動(dòng)子分別經(jīng) KpnⅠ和 XhoⅠ雙酶切、回收,同時(shí)將熒光素酶報(bào)告基因 p GL3-Basic載體也進(jìn)行 KpnⅠ和 XhoⅠ雙酶切、回收。然后將各系列啟動(dòng)子分別與 p GL3-Basic載體在 T4連接酶的作下于 16℃連接 12 h,再以低溫 CaCl2法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入 E.coli JM 109,涂布于含 100 mg/L氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)皿上過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落培養(yǎng)后經(jīng) 99℃、5 min熱裂解,取上清做PCR鑒定陽性克隆,并以質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒進(jìn)行 KpnⅠ和 XhoⅠ雙酶切鑒定。

2.3 IL-15基因啟動(dòng)子報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染 HaCaT細(xì)胞與活性檢測(cè)

將含最長(zhǎng)序列 (2 086 bp)啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒p GL3-Basic-IL-15PromoterF0、陰性對(duì)照 p GL3-Basic載體和內(nèi)參照 phRL-CMV載體經(jīng)紫外分光光度儀測(cè)定在 260 nm波長(zhǎng)處的吸光度值進(jìn)行定量。轉(zhuǎn)染前 1天將 HaCaT細(xì)胞以 1×105/孔密度接種于 24孔板,第 2天當(dāng)細(xì)胞約 90%融合時(shí),每孔先加入無血清無雙抗 DMEM 400μL,再分別定量加入含p GL3-Basic-IL-15PromoterF0重組質(zhì)粒 (或空載體p GL3-Basic,作為對(duì)照組)0.8μg,phRL-CMV內(nèi)參照載體 80 ng和 Lipofectamine 2000 2μL的無血清無雙抗 DMEM混合液 100μL,每組各計(jì) 6孔,并設(shè)兩組復(fù)孔,置 37℃,5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。6 h后棄培養(yǎng)液,換成全培養(yǎng)基,并將空載體對(duì)照組和重組載體兩組再各分為兩組,其中一組設(shè)置為空白對(duì)照組,另一組用 100 ng/mL脂多糖 (LPS)處理。18 h后棄培養(yǎng)液,磷酸鹽緩沖液洗一遍,以被動(dòng)裂解液 (PLB)在室溫下輕晃 15 min裂解細(xì)胞,再取裂解液 20μL加底物熒光素 (LARⅡ)100μL在ModulusTM多功能光度計(jì)上測(cè)定螢火蟲熒光素酶活性,后加入終止液 100μL檢測(cè)海腎熒光素酶活性,計(jì)算兩種熒光素酶活性的比值,并以空載體 p GL3-Basic比值作對(duì)照,分析啟動(dòng)子活性。

3 結(jié) 果

3.1 IL-15基因系列啟動(dòng)子的克隆

以 HaCaT細(xì)胞基因組 DNA為模板,克隆出七段 IL-15基因系列啟動(dòng)子,分別命名為 F0 2 086 bp;F1 1 841 bp;F2 1 586 bp;F3 1 236 bp;F4 1 084 bp;F5 827 bp;F6 548 bp(圖1)。

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 PCR agarose gel electrophoresis

3.2 IL-15啟動(dòng)子報(bào)告基因載體的 PCR鑒定

如圖 2所示,從挑選的陽性單克隆菌落裂解液中 PCR擴(kuò)增到 IL-15基因的系列啟動(dòng)子,初步證實(shí)重組體構(gòu)建成功。

圖2 PCR鑒定電泳圖Fig.2 The electrophoresis of PCR for identification

3.3 IL-15啟動(dòng)子報(bào)告基因載體的酶切鑒定

經(jīng) KpnⅠ和 XhoⅠ雙酶切后,各重組體均得到同一大小的空載體 p GL3-Basic(4 808 bp)片段和不同大小的系列啟動(dòng)子片段,進(jìn)一步證實(shí) IL-15系列啟動(dòng)子報(bào)告基因載體構(gòu)建成功 (圖 3)。

圖3 空載體 p GL3-Basic及雙酶切電泳圖Fig.3 The electrophoresis of p GL3-Basic and double digestion for identification

3.4 啟動(dòng)子活性的檢測(cè)

報(bào)告基因熒光檢測(cè)顯示,p GL3-Basic空載體及p GL3-Basic-IL-15PromoterF0重組體轉(zhuǎn)染 HaCaT細(xì)胞后表現(xiàn)出啟動(dòng)子活性。圖 4所示為重組體 F0與空載體各自的螢火蟲熒光值與海腎熒光值之比,其中空白對(duì)照組的 F0重組體/空載體熒光比值為1.35;LPS組的 F0重組體 /空載體熒光比值為5.23;p GL3-Basic-IL-15PromoterF0的 LPS組 /空白對(duì)照組熒光比值為 4.05(各數(shù)據(jù)比較:P＜0.05),說明 LPS組及空白對(duì)照組其重組體 F0轉(zhuǎn)染前后的熒光值有差異,且 LPS組更明顯。由此可得 p GL3-Basic-IL-15PromoterF0具有啟動(dòng)子活性,提示所克隆及重組的 IL-15基因 5′上游 2 086 bp片段內(nèi)包含核心啟動(dòng)子序列。

圖4 p GL3-Basic-IL-15PromoterF0啟動(dòng)子活性Fig.4 The activity of p GL3-Basic-IL-15PromoterF0

4 討 論

IL-15在機(jī)體自然免疫中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[3-4]。IL-15功能多樣,涉及外周血 T細(xì)胞的增殖、活化B細(xì)胞抗體的分泌、NK細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌[5]及抗病毒作用[6]等,其正常表達(dá)是機(jī)體自然免疫功能的重要維系,異常表達(dá)則與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病和艾滋病等密切相關(guān)[2],因此研究 IL-15基因表達(dá)調(diào)控及其機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前對(duì) IL-15基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究還處在一個(gè)不充分的水平,人們僅發(fā)現(xiàn)在其基因調(diào)控序列中存在有常見的保守性序列,即 IRF[7],NF-κB[8],g-IRE,myb和 GCF等結(jié)合位點(diǎn),部分與 IL-15調(diào)控有關(guān)的未知序列[9]以及由 mRNA翻譯成前體蛋白過程中的幾個(gè)調(diào)控點(diǎn)[10]。我們的研究意在尋找 IL-15基因 5′上游調(diào)控序列的核心啟動(dòng)子區(qū)域,試圖更加充實(shí)和完善 IL-15基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。

報(bào)告基因技術(shù)近年來普遍用于分析啟動(dòng)子活性,尤其是單管雙報(bào)告酶系統(tǒng),其靈敏度高、檢測(cè)方便且具有內(nèi)參照系統(tǒng) phRL-CMV,可以實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因測(cè)試的歸一化,提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度。因此我們根據(jù)相關(guān)啟動(dòng)子分析軟件設(shè)計(jì)了七對(duì)逐步缺失的啟動(dòng)子引物,經(jīng) PCR從 HaCaT細(xì)胞基因組克隆出系列啟動(dòng)子構(gòu)建到含螢火蟲熒光素酶的報(bào)告基因載體p GL3-Basic上,然后經(jīng)過 PCR和雙酶切鑒定,證實(shí)成功構(gòu)建 IL-15基因系列啟動(dòng)子報(bào)告基因載體。在此基礎(chǔ)上,對(duì)啟動(dòng)子活性的初步分析中我們選擇了其中一個(gè)含最長(zhǎng)啟動(dòng)子序列的報(bào)告基因載體 p GL3-Basic-IL-15PromoterF0(同時(shí)另轉(zhuǎn)染空載體 p GL3-Basic做陰性對(duì)照)和內(nèi)參照海腎報(bào)告基因載體phRL-CMV一同經(jīng) Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染至 HaCaT細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和 LPS組處理,經(jīng)熒光檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)兩組均具有啟動(dòng)子活性,且 LPS組活性較空白對(duì)照組更明顯。這進(jìn)一步證實(shí)報(bào)告基因載體構(gòu)建成功,同時(shí)也證明我們選擇的 IL-15基因調(diào)控序列中包含其核心啟動(dòng)子序列,為下一步 IL-15基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1] Grabstein K H,Eisenman J,Shanebeck K,et al.Cloning of a Tcell growth factor that interacts with theβchain of the interleukin-2 receptor[J].Science,1994,264(5161):965-968.

[2] Fehniger TA,CaligiuriM A.Interleukin 15:biology and relevance to human disease[J].Blood,2001,97(1):14-32.

[3] Ohteki T,Tada H,Ishida K,et al.Essential roles of DC-derived IL-15 as a mediator of inflammatory responses in vivo[J].JEM,2006,203(10):2329-2338.

[4] Tran P,Ahmad R,Xu J,et al.Host′s innate immune response to fungal and bacterial agents in vitro:up-regulation of interleukin-15 gene expression resulting in enhanced natural killer cell activity[J].Immunology,2003,109(2):263-270.

[5] Boyiadzis M,Memon S,Carson J,et al.Upregulation of NK cell activating receptors following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation under a lymphodepleting reduced intensity regimen is associated with elevated IL-15 levels[J].Biol Blood Marrow Transplant,2008,14(3):290-300.

[6] Gill N,Ashkar A A.Overexpression of interleukin-15 compromises CD4-dependent adaptive immune responses against herpes simplex virus2[J].Virology,2009,83(2):918-926.

[7] Ogasawara K,Hida S,Azimi N,et al.Requirement for IRF-1 in the microenvironment supporting development of natural killer cells[J].Nature,1998,391(1):700-703.

[8] Washizu J,Nishimura H,Nakamura N,et al.The NF-kappaB binding site is essential for transcrip tional of the IL-15 gene[J].Immunogenetics,1998,48(1):1-7.

[9] Azimi N,Brown K,Bamford RN,et al.Human T cell lymphotropic virus typeⅠTax protein trans-activates interleukin 15 gene transcription through an NF-kappaB site[J].Proc Natl Acad SciUSA,1998,95(5):2452-2457.

[10]Kozak M.Regulation of translation in eukaryotic systems[J].Annu Rev Cell Dev Biol,1992,8:197-225.

Construction of human IL-15 gene promoter luciferase reporter gene vectors

TAO Qian-shan,LUO Xin,CHA IYu,HU Dao-jun,ZHANG Sheng-quan
(Department of Biochemistry and Molecular Biology,Anhui Medical University,Hefei 230032,China)

Purpose To clone series of the human IL-15 gene promoter and to construct seven luciferase reporter gene vectors containing IL-15 promoter regions.Methods Seven DNA fragments of the 5′flanking region of human IL-15 gene were isolated from genomic DNA of HaCaT cellsby polymerase chain reaction(PCR).After being digested with restriction enzymes,IL-15 gene family promoters were inserted into the luciferase reporter vectors PGL3-Basic.Then the recombinant construct which contains the largest IL-15 promoter region was transiently transfected into HaCaT cells.6 hours later,cells were respectively treated with DMEM,LPS.Then the activity of luciferase was detected.Results Seven-fragments of IL-15 gene promoter were amplified by PCR,and the identification of PCR and double digestion of recombined plasmid was completely correct.The experiment of transient transfection showed that the largest IL-15 promoter region has the significant activity.Conclusion The human IL-15 gene promoter luciferase reporter gene vectors have been constructed successfully.The analysis of activity in HaCaT cells indicated that the cloned IL-15 gene family promoters contain the key cis-regulatory elements.It will be essential to further study the regulation of IL-15 expression.

IL-15;Promoter;Dual luciferase reporter gene

Q782;Q785

A

1005-1678(2011)03-0187-04

2010-06-28

安徽省自然科學(xué)基金 (050430604);安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室優(yōu)秀中青年科研帶頭人專項(xiàng)基金

陶千山,男,在讀碩士研究生;張勝權(quán),通信作者,副教授,博士,E-mail:sqz36@yahoo.com。