葉春秀，牛建新

（1石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系，石河子832003；2新疆農(nóng)墾科學(xué)院分子農(nóng)業(yè)技術(shù)育種中心，石河子832000）

新疆核桃AP1同源基因部分片段的克隆與表達(dá)分析

葉春秀1，2，牛建新1

（1石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系，石河子832003；2新疆農(nóng)墾科學(xué)院分子農(nóng)業(yè)技術(shù)育種中心，石河子832000）

為了分離新疆早實(shí)核桃上與花分生組織相關(guān)的基因，以早實(shí)核桃的花芽為實(shí)驗(yàn)材料，通過對不同植物的AP1保守區(qū)核苷酸序列分析，設(shè)計(jì)1對引物，采用RT－PCR的方法克隆獲得1條長度為463 bp的PCR產(chǎn)物，命名為Jr AP1。該片段與其他植物的AP1同源基因序列同源性達(dá)70%～86%，推測所得的基因?yàn)锳P1基因的同源基因?qū)ζ淙L和功能將進(jìn)行進(jìn)一步研究分析。初步RT－PCR分析的結(jié)果表明：Jr AP1在早實(shí)核桃的頂芽、花芽、枝條、果實(shí)、老葉、嫩葉上都有表達(dá)，說明了該基因參與了早實(shí)核桃的營養(yǎng)生長和生殖生長。而且其在新疆早實(shí)核桃及晚實(shí)核桃上都能夠得到表達(dá)，擴(kuò)增產(chǎn)物亮度早實(shí)核桃＞晚實(shí)核桃，推測其可能在早實(shí)機(jī)制上起到一定的作用。

核桃；花分生組織；APETALA1（AP1）基因；表達(dá)特征

開花是高等植物生活史中一個(gè)質(zhì)變過程，是植物個(gè)體發(fā)育過程的中心環(huán)節(jié)。高等植物花的形態(tài)建成是基因和環(huán)境共同作用的復(fù)雜過程，花在發(fā)育過程中，花器官的類型、數(shù)目和位置均受到嚴(yán)格的控制?；òl(fā)育過程是果樹生長發(fā)育過程中的重要轉(zhuǎn)折時(shí)期，成花的遲早對果樹產(chǎn)量有著直接的影響，進(jìn)而影響著經(jīng)濟(jì)效益。果樹實(shí)生樹從播種到第1次開花的童期一般較長，這是一直以來困擾育種家和生產(chǎn)者的一大難題，誘導(dǎo)果樹早花在育種和實(shí)踐過程中均具有重要意義?？刂乒麡浠òl(fā)育的基因種類繁多，決定著果樹花發(fā)育的時(shí)間、特征和數(shù)量。目前，已從形態(tài)、生理、內(nèi)含生化物質(zhì)、激素等方面對果樹成花進(jìn)行探索，在果樹花發(fā)育機(jī)理和調(diào)控花發(fā)育過程的方法，取得了不少研究成果，但對成花的本質(zhì)機(jī)理知之甚少，若能直接研究調(diào)控果樹開花的基因和克隆出這些基因，無疑將把花發(fā)育基因研究推進(jìn)到新的高度，并對年周期中花芽分化機(jī)理研究提供最本質(zhì)的依據(jù)［1－2］。

自從在模式植物擬南芥和金魚草中獲得控制花發(fā)育的基因以來，已經(jīng)相繼在許多植物上克隆得到了與開花誘導(dǎo)相關(guān)的基因，如，AP1（花分生組織）基因就是其中一個(gè)與開花誘導(dǎo)相關(guān)的重要基因，其能促進(jìn)開花，在花器官形成過程中起重要作用，同時(shí)也初步構(gòu)建了花器官發(fā)育過程的遺傳和調(diào)控模型［7－8］。目前，在棗［3］、蘋果［4］、龍眼［5］、山核桃［6］等果樹上已經(jīng)有相關(guān)的報(bào)道。

新疆核桃群體中的早實(shí)核桃表現(xiàn)出開花較早，1年能開2次花的特性引起了研究者的注意，并且期望能夠通過從分子水平上對早實(shí)核桃開花機(jī)制進(jìn)行研究。目前，新疆早實(shí)核桃的研究大多集中在與早實(shí)性相關(guān)的分子標(biāo)記，本實(shí)驗(yàn)室也有相關(guān)報(bào)道［9］，而對花發(fā)育相關(guān)基因的研究較少。本研究從新疆早實(shí)核桃上克隆與花分生組織發(fā)育相關(guān)的AP1同源基因，并進(jìn)行進(jìn)一步研究，期望得到相關(guān)基因的全序列和合適的表達(dá)載體構(gòu)建體系，并對其功能進(jìn)行驗(yàn)證分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

實(shí)驗(yàn)材料為采自新疆省輪臺資源圃的早實(shí)核桃材料新早豐及晚實(shí)核桃材料和田20號，采集花芽組織，液氮處理后－70℃保存，用于RNA的提取。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒載體

菌株為大腸桿菌XL1（為本實(shí)驗(yàn)室保存），PMD19－T載 體，Taq 酶，200 bp Mar ker（D514），d NTPs等購自Ta Ka Ra公司，其它均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù) Gen Bank和相關(guān)資料［6，10］，已克隆的 AP1基因序列的保守區(qū)，應(yīng)用Pri mer premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)1對引物，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，序列如下：

AP正：5′－GCAGCAGCTTGATACTACTCTTA －3′；

AP反：5′－GTTTTGCTCCTGTATTGCCTTCT－3′。

1.2.2 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

總RNA的提取方法參照本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的方法［11］，提取的總RNA直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)或－80℃保存?zhèn)溆谩Ｒ蕴崛〉目俁NA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)，合成c DNA第一鏈，具體操作如下：DEPC水12.5 μL，總RNA 2.0μL，互補(bǔ)引物1.0μL，離心混勻，70℃水浴5 min，冰浴5 min；在冰上依次加入5×M－MLV Buffer 5.0μL，d NTP 2.5μL，RNase 1.0 μL，42℃水浴5 min；加入 M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL，42℃水浴1 h，立即放入92℃滅活4 min，即可獲得c DNA第一鏈，直接PCR或－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 特異片段的克隆與分析

取上述反轉(zhuǎn)錄液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：dd H2O 13.4μL，10×buffer（含 Mg2＋）2.0μL，d NTPs 0.4μL，引物各1.0μL，DNA 2.0μL，Taq酶0.2μL。反應(yīng)液混合后在微型離心機(jī)上微甩，置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸80 s，32個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min，4℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外凝膠成像儀上觀察，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

對目的片段采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP1602）回收，將回收純化的片段連接到PMD19－T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 XL1－Bl ue中，利用IPTG誘導(dǎo)X－Gal為底物顯色反應(yīng)篩選可能重組子，挑取白斑于液體LB培養(yǎng)基中，37℃搖菌過夜，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和PCR鑒定。鑒定結(jié)果初步正確的菌液送上海生工測序，測序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行BLAST檢索比對，利用BLASTx程序?qū)@得的氨基酸序列與不同植物同源性進(jìn)行相似性分析。

1.2.4 新疆核桃AP1同源基因在不同品種及組織中的表達(dá)

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用引物AP正和AP反分析該基因在新早豐、和田20號及早實(shí)核桃頂芽、花芽、枝條、果實(shí)、嫩葉、老葉不同組織上的表達(dá)。取2.0μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件同1.2.3。產(chǎn)物采用1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃AP1同源基因的克隆

根據(jù)相關(guān)資料發(fā)表的AP1同源基因的序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，以早實(shí)核桃材料花芽提取的總RNA為模板，合成c DNA，進(jìn)行PCR，獲得了長度為463 bp的片段，并進(jìn)行克隆與鑒定（圖1），得到了與預(yù)期結(jié)果大小一致的擴(kuò)增產(chǎn)物，PCR檢測與擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致，說明得到了重組子，將鑒定結(jié)果初步正確的菌液寄上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序。

圖1 Jr AP1 PCR擴(kuò)增Fig.1 The PCR result of Jr AP1

2.2 核桃AP1同源基因核酸的序列分析

將測序結(jié)果采用DNA MAN或DNAstar和NCBI相關(guān)軟件進(jìn)行初步分析并提交，利用Gen－Bank／BLAST（局部性相似基本查詢工具）進(jìn)行同源性比對，結(jié)果表明獲得的AP1基因的同源基因大小為463 bp（如圖3），分析顯示該片段含有1個(gè)最大為150 bp的開放閱讀框，編碼50個(gè)氨基酸。該片段與其他部分植物相關(guān)基因的同源性比對結(jié)果顯示，相關(guān)基因的同源性在70%～86%（表1），其中，同源性最高的是桃（Prunus persica）和月季（Rosa hybrid cultivar），達(dá)到86%；最低的為枇杷（Eriobotrya japonica），也有70%的同源率，說明克隆得到的是核桃AP1基因的同源基因片段，命名為Jr AP1。

圖2 質(zhì)粒PCR鑒定Fig.2 The result of plasmid PCR

圖3 新疆核桃AP1同源基因核苷酸及氨基酸序列Fig.3 The nucleotide and amino acid of AP1 homology gene of walnut in Xinjiang

表1 Jr AP1核苷酸序列與其它植物同源性分析Tab.1 The result of compare bet ween AP1 homologous genes in Walnut and other plant

2.3 Jr AP1的表達(dá)分析

AP1基因是影響花分生組織特征的一個(gè)基因，在時(shí)空上調(diào)節(jié)花分生組織的形成和花器官的發(fā)生，是萼片和花瓣等花器官正常發(fā)育的一個(gè)必需因子。通過在早實(shí)與晚上核桃上的表達(dá)分析（圖4），發(fā)現(xiàn)AP1同源基因在新疆早實(shí)核桃與晚實(shí)核桃之間的擴(kuò)增產(chǎn)物亮度存在著差異，初步預(yù)測該基因在早實(shí)核桃與晚實(shí)核桃之間表達(dá)量存在著差別，且晚實(shí)核桃上的表達(dá)量低于早實(shí)核桃，推測可能是基因的拷貝數(shù)量存在差異，進(jìn)而影響了基因的功能差異，這一結(jié)果需要進(jìn)一步的精確定量分析進(jìn)行驗(yàn)證。在早實(shí)核桃的不同部位的檢測表明AP1同源基因在早實(shí)核桃的整個(gè)生長過程中都起著相應(yīng)的作用，在早實(shí)核桃不同組織都有基因的表達(dá)，但在頂芽、花芽、枝條上的產(chǎn)物亮度低于在果實(shí)、嫩葉、老葉上的產(chǎn)物亮度（圖5）。

圖4 AP1部分序列在早實(shí)與晚實(shí)核桃上的擴(kuò)增Fig.4 Comparing AP1 partial sequence bet ween precocious and later－seeding walnut

圖5 AP1部分序列在早實(shí)核桃不同組織上的擴(kuò)增Fig.5 Comparing AP1 partial sequence bet ween precocious and later－seeding walnut

3 討論與結(jié)論

根據(jù)不同植物AP1保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，從新疆早實(shí)核桃花芽中克隆得到Jr AP1基因的c DNA部分序列，為獲得該基因全長序列提供一定的研究信息。NCBI上核苷酸同源性比對結(jié)果顯示：其與其它植物上的AP1基因同源性較高，說明該基因的保守性較高，即可通過較高同源性的基因推導(dǎo)該基因的功能。

不同核桃品種及早實(shí)核桃不同組織之間的初步表達(dá)分析顯示：Jr AP1在晚實(shí)核桃與早實(shí)核桃上均有表達(dá)，且擴(kuò)增產(chǎn)物的亮度存在著差異，推測這種差異可能在早實(shí)機(jī)制上起到直接的作用，這需要借助于于Souther n印跡雜交、熒光定量PCR進(jìn)行準(zhǔn)確的拷貝數(shù)及定量分析。該基因在早實(shí)核桃的不同組織上也都能夠進(jìn)行表達(dá)，說明該基因參與了核桃的營養(yǎng)及生殖的生長，伴隨整個(gè)生長過程，屬于組成型表達(dá)。其在果實(shí)和花芽上均有表達(dá)，這類似與其它大部分植物的繁殖器官表達(dá)［12］，并且在果實(shí)上的表達(dá)量高于頂芽、枝條、花芽、老葉及嫩葉。在營養(yǎng)器官的表達(dá)方面，該基因在早實(shí)核桃上的表達(dá)與在擬南芥［13］的表達(dá)不同：在營養(yǎng)器官枝、葉片中也存在著基因的表達(dá)，而與棗中的Zj AP1［3］、蘋果中的 MADS5［4］的表達(dá)一致。在營養(yǎng)器官中都存在著基因的表達(dá)，說明了該基因在早實(shí)核桃上也存在著不同于一些物種同源基因的表達(dá)特征，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

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Cloning and Expression Analysis of the AP1 Homolog Gene in Jugl ans regia L.

YE Chunxiu，NIU Jianxin
（1 Department of Horticulture，Agricultural College，Shihezi University，Shihezi 832003，China；2 Center for Molecular Agrobiotechnology and Breeding，Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences，Shihezi 832000，China）

In t his experi ment，we designed a pairs of primers accor ding to the conservative regions of floral meristem identity genes－APETALA1（AP1）homologous genes.About 463 bp fragment of this homologous gene was amplified by RT－PCR using the pair of pri mers fro m t he genomic RNA of walnut.The result of blasting sequence indicates that the homology reaches 70%～86%of the other AP1 homologous gene.It was named Jr AP1.We guess this fragment was the homologous gene of AP1，and we will research its function and the full length in further.Expression analysis of Jr AP1 was detected in different tissue in precocious by RT－PCR，the result sho wed that this gene could be expressed with vegetative and reproductive growth.There were expression bet ween later－seeding walnut and precocious walnut，but the expression in early－seeding was stronger than another，it was maybe related to the character of precocious.

walnut；floral－meristem gene；APETALA1（AP1）gene；expression pattern

S722.3

A

1007－7383（2011）06－0679－04

2011－08－04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30560090），新疆維吾爾族自治區(qū)重大專項(xiàng)（201130102－1－4）

葉春秀（1982－），女，副研究員，博士，從事果樹生物技術(shù)研究；e－mail：yecx2008＠163.co m。

牛建新（1962－），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事果樹與生物技術(shù)研究；e－mail：njx105＠163.co m。