孫世偉，林貞健，朱天驕，李德海，顧謙群

（中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，教育部海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003）

老鼠簕植物內(nèi)生真菌Aspergillus terreus（W－8）抗腫瘤活性成分的研究＊

孫世偉，林貞健，朱天驕，李德海，顧謙群＊＊

（中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，教育部海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003）

對(duì)紅樹林植物的枝干、枝葉樣品進(jìn)行微生物分離，以P388細(xì)胞為模型進(jìn)行活性評(píng)價(jià)得到14株具有抗腫瘤活性的真菌。采用溶劑萃取、柱色譜及半制備HPLC等分離手段對(duì)來(lái)源于紅樹林植物老鼠簕Acanthus ilicifolius Linn．的菌株Aspergillus terreus（W－8）發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了活性追蹤分離，共得到5個(gè)化合物。通過(guò)理化性質(zhì)及波譜技術(shù)，結(jié)合文獻(xiàn)，鑒定其結(jié)構(gòu)分別為aspulvinone H1（1）、aspulvinone H（2）、butyrolactone I（3）、terrein（4）和3－propylbenzene－1，2－diol（5），其中化合物1的核磁數(shù)據(jù)為首次報(bào)道。采用MTT法初步評(píng)價(jià)了單體化合物的抗腫瘤活性，結(jié)果表明化合物4、5對(duì)A549、K562和Hela細(xì)胞均具有中等強(qiáng)度的細(xì)胞毒活性。

紅樹林植物；內(nèi)生真菌；次級(jí)代謝產(chǎn)物；抗腫瘤活性；老鼠簕

植物內(nèi)生真菌是指在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織、器官內(nèi)部的真菌，被感染的宿主植物不表現(xiàn)出外在病癥［1－2］。它不僅包括互惠共利的和中性的內(nèi)共生真菌，也包括那些潛伏在宿主體內(nèi)的病原菌［3］。內(nèi)生真菌廣泛存在于植物體的根、莖、葉、花、果和種子等器官組織的細(xì)胞或細(xì)胞間隙，不同的內(nèi)生真菌往往占據(jù)不同的生態(tài)位。它們?cè)谥参矬w中相互作用，維持著微生態(tài)的平衡。在這個(gè)平衡的體系中，寄生植物為內(nèi)生真菌提供營(yíng)養(yǎng)，作為回報(bào)，內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的藥用活性成分來(lái)增強(qiáng)寄生植物在自然界的競(jìng)爭(zhēng)力［4－6］，因此采用微生物發(fā)酵的方法獲得植物中有效成分，是解決植物源藥用成分有效新途徑之一。自從美國(guó)蒙大拿州立大學(xué)的Strobel小組［7］在短葉紅豆杉內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae中發(fā)現(xiàn)紫杉醇，國(guó)內(nèi)外掀起了一股對(duì)藥用植物和瀕危植物內(nèi)生真菌的研究熱潮?；趦?nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似化學(xué)成分這一觀點(diǎn)，人們從具有抗腫瘤活性的植物入手，進(jìn)行了內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究并得到了很有價(jià)值的研究成果。

紅樹林是指熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落，是海岸帶極為獨(dú)特的生態(tài)景觀，素有“海上森林”和“海上衛(wèi)士”之稱［8］，是熱帶海岸地帶一種重要的濕地類型和重要的生態(tài)系統(tǒng)，蘊(yùn)藏著極為豐富和多樣的微生物群落。特殊的生存環(huán)境使紅樹林微生物有可能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)獨(dú)特、生理活性獨(dú)特的次級(jí)代謝產(chǎn)物。因此，研究紅樹林微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物具有重要意義。本研究室近年選擇紅樹林這一可持續(xù)再生的重要資源，對(duì)分別采自廣東高橋紅樹林保護(hù)區(qū)和廈門九龍江口紅樹林濕地的桐花樹（Aegiceras corniculatum）枝葉、枝干及海口東寨港紅樹林自然保護(hù)區(qū)的老鼠簕（Acanthus ilicifolius Linn．）枝葉的3個(gè)樣品采用P388小鼠白血病細(xì)胞系為模型進(jìn)行篩選，從中得到14株活性紅樹林內(nèi)生真菌。通過(guò)菌株抗腫瘤活性篩選結(jié)合化學(xué)篩選以及HPLC指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于老鼠簕（A．ilicifolius Linn．）枝葉內(nèi)生真菌A．terreus（W－8）的粗浸膏對(duì)小鼠白血病細(xì)胞P388具有明顯的細(xì)胞毒活性，HPLC指紋圖譜顯示具有紫外吸收相似的系列色譜峰，提示可能含有結(jié)構(gòu)相近的代謝產(chǎn)物，基于以上分析選取該菌株進(jìn)行大量發(fā)酵，并采用活性追蹤的方法，對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物中活性次級(jí)代謝進(jìn)行了提取分離，從中得到5個(gè)單體化合物，并采用MTT方法初步評(píng)價(jià)了化合物的細(xì)胞毒活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 試驗(yàn)試劑和儀器

恒溫培養(yǎng)箱：MIR－253（SANYO公司）；高壓滅菌鍋：MLS3750（日本三洋株式會(huì)社）；超聲儀：VC750（美國(guó)SONICS公司）；潔凈工作臺(tái)：Air Tech（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；試管式振動(dòng)培養(yǎng)箱：TC－C－100R（高崎科學(xué)器械株式會(huì)社）；高速離心機(jī)：（德國(guó)BECKMAN公司）；旋轉(zhuǎn)式振動(dòng)培養(yǎng)箱：TC－C－100R（高崎科學(xué)器械株式會(huì)社）；二氧化碳培養(yǎng)箱：MCO175（SANYO公司）；真空濃縮儀：SC250DDA（Savant公司）；EYELAN－N型旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀：Tokyo Rikakikai CO．LTD；相差倒置顯微鏡：CK40（OLYMPUS公司）；超凈工作臺(tái)：MCV－131BNF（T）（SANYO公司）；質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters Q－TOF Ultima Global型質(zhì)譜儀；核磁共振儀：日本JEOL JNM－ECP600型；制備高效液相色譜：日本島津公司產(chǎn)品（LC－6AD泵，SPD－M20AVP檢測(cè)器，SCL－10AV型系統(tǒng)控制器，YMC－pack ODS（A），10mm×250mm，5μm，4mL／min）；硅膠H（200～400目）：青島海洋化工廠產(chǎn)品；Sephadex LH－20：Pharmacia公司。LiChroprep?RP－18（25～40 μm）：Merck公司產(chǎn)品?；钚詼y(cè)試采用人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞、人肺腺癌A549細(xì)胞和人體慢性髓性白血病細(xì)胞K562；胎牛血清（FBS）和RPMI－1640細(xì)胞培養(yǎng)基分別為Hyclone公司（Cat．No．STF721）和GIBCOBRLD公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）為Sigma公司產(chǎn)品。

常規(guī)提取分離用丙酮、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿等均為工業(yè)用化學(xué)純產(chǎn)品，重蒸后使用，液相色譜甲醇為色譜純。

1．2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1．2．1 樣品來(lái)源 供分離的樣品來(lái)自廣東高橋紅樹林保護(hù)區(qū)和廈門九龍江口紅樹林濕地的桐花樹（A．corniculatum）枝葉、枝干，?？跂|寨港紅樹林自然保護(hù)區(qū)的老鼠簕（A．ilicifolius Linn．）枝葉。

1．2．2 真菌培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基：采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基與以紅樹林植物枝葉煮水制作的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糖2%，葡萄糖1%，甘露醇2%，味精1%，MgSO4·7H2O 0．03%，KH2PO40．05%，玉米漿0．1%，酵母浸膏0．3%，pH＝6．5。

1．2．3 細(xì)胞毒活性篩選模型 細(xì)胞培養(yǎng)：活性篩選采用小鼠白血病P388細(xì)胞系。細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，在通入5%二氧化碳的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。

細(xì)胞鏡檢：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P388細(xì)胞，用含10%FBS的新鮮DMEM培養(yǎng)基配制成2×105個(gè)／mL的細(xì)胞懸液，接種到24孔板中，每孔0．5mL。每孔再加5 μL樣品溶液，空白對(duì)照留復(fù)孔。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)17h后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，記錄樣品的活性結(jié)果。

1．3 紅樹林植物來(lái)源真菌分離方法［9］

處理方法：采用組織切片培養(yǎng)法及勻漿涂布法分離內(nèi)生真菌［7］。紅樹林植物枝葉樣品用75%酒精和0．02%的氯化汞進(jìn)行表面消毒，用無(wú)菌水沖洗3～5次，在潔凈臺(tái)內(nèi)晾干。

組織切片法：葉子直接切碎（0．5cm×0．5cm）鋪于培養(yǎng)基表面培養(yǎng)；枝干先削去表皮，切碎（0．5cm×0．5cm）后平鋪于培養(yǎng)基表面培養(yǎng)。

勻漿涂布法：將處理后樣品（枝干內(nèi)表皮和葉片）0．5g加2mL的無(wú)菌水，于研缽中充分研磨后，取0．2 mL的勻漿液作10－1、10－2、10－3、10－4倍的梯度稀釋后涂布于培養(yǎng)基表面培養(yǎng)。

28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d左右，開始長(zhǎng)出菌絲，4周后菌絲鋪滿培養(yǎng)皿，因此，4周前挑取尖端菌絲移至新的培養(yǎng)基上，幾次純化后得單一菌落并轉(zhuǎn)接到試管斜面上保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 菌株發(fā)酵提取物的準(zhǔn)備

從試管斜面取活化培養(yǎng)的真菌適量，接種到含5 mL液體培養(yǎng)基的試管（20mm×200mm）中，于28℃試管搖床中230r·min－1振蕩培養(yǎng)7～9d。取發(fā)酵產(chǎn)物，超聲破碎，按體積比加入2倍量的乙酸乙酯，靜置過(guò)夜，離心取上清液，濃縮至干，得到固體浸膏。浸膏精確稱重，用甲醇配制成相應(yīng)濃度供使用。

1．5 目標(biāo)菌株的培養(yǎng)

1．5．1 目標(biāo)菌株真菌W－8（A．terreus），來(lái)源于?？跂|寨港紅樹林自然保護(hù)區(qū)的老鼠簕（A．ilicifolius Linn．）枝葉。

1．5．2 發(fā)酵培養(yǎng) 真菌2號(hào)培養(yǎng)基：葡萄糖2%，麥芽糖2%，味精1%，KH2PO40．05%，MgSO4·7H2O 0．03%，酵母浸膏0．3%，玉米漿0．1%，甘露醇2%，陳海水配制，pH＝6．5。

培養(yǎng)方法：取菌株孢子適量，接種到100個(gè)含300 mL培養(yǎng)液（真菌2號(hào)培養(yǎng)基）的1000mL三角玻璃搖瓶中，在室溫條件下培養(yǎng)30d，獲得發(fā)酵液30L。

1．6 活性測(cè)試

化合物抗腫瘤活性采用MTT法［10］，結(jié)合顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2．1 紅樹林植物來(lái)源真菌分離

分別采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和以紅樹林植物枝葉煮水制作的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基作為分離培養(yǎng)基，3個(gè)樣品中共分得42株內(nèi)生真菌。

2．2 篩選結(jié)果

從42株紅樹林內(nèi)生真菌中初步篩選出對(duì)小鼠白血病P388細(xì)胞具有抑制活性的菌株14株，陽(yáng)性率為33%，具體結(jié)果見表1。

表1 P388細(xì)胞抑制活性菌株篩選結(jié)果Table 1 The screening result of cytotoxicities of fungi against P388

2．3 目標(biāo)菌株的確定

在考慮菌株的活性基礎(chǔ)上，我們對(duì)其代謝產(chǎn)物的薄層色譜和高效液相指紋圖譜特征綜合分析，最終選擇出進(jìn)一步研究的菌株［9］。

2．3．1 薄層色譜（TLC）法 展開系統(tǒng)：CHCl3∶MeOH＝10∶1；顯色劑：濃硫酸－香草醛試劑。部分活性菌株的TLC薄層分析結(jié)果如圖1所示：

圖1 活性菌株的TLC數(shù)據(jù)Fig．1 The TLC analysis of active strains

2．3．2 高效液相色譜（HPLC）法 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期的研究積累，確定柱系統(tǒng)：YMC－Pack ODSA，250×4．6mm；進(jìn)樣量：10μL；樣品濃度：20mg／mL；流動(dòng)相：A－甲醇，B－水，梯度洗脫：A相（體積%），0～5min（5），5～45min（5～100），45～55min（100）；流速：1．0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：全波長(zhǎng)檢測(cè)。

經(jīng)過(guò)對(duì)比我們發(fā)現(xiàn)真菌W－8的次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富且對(duì)小鼠白血病P－388細(xì)胞有抑制活性，結(jié)合HPLC指紋圖譜提示菌株W－8具有特征紫外吸收的同系物色譜峰，由此確定真菌W－8作為進(jìn)一步的研究對(duì)象。菌株W－8的指紋圖譜如圖2所示。

圖2 活性菌株W－8的HPLC分析Fig．2 The HPLC analysis of active strain W－8

2．4 浸膏提取分離［9］

將發(fā)酵液過(guò)濾，分為上清液和菌絲體。取上清液，用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并，得上清液的乙酸乙酯萃取液。菌絲體用80%丙酮水溶液超聲提取3次，合并提取液，減壓濃縮至不含丙酮后，用等體積乙酸乙酯萃取3次，得菌絲體提取物的乙酸乙酯萃取液，合并乙酸乙酯相減壓濃縮至干，得到總浸膏35．0g。

總浸膏采用減壓硅膠柱層析，以石油醚－氯仿，氯仿－甲醇為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，分為10個(gè)組分。其中組分Fr．－5和組分Fr．－8經(jīng)反復(fù)的正、反相柱層析、Sephadex LH－20柱層析和制備型高效液相色譜等分離手段，得到化合物1（25mg），化合物2（16mg），化合物3（2．0mg），化合物4（20．5mg），化合物5（3．5mg）。

2．5 化合物結(jié)構(gòu)解析

化合物1，黃色油狀物。陽(yáng)離子ESI－MS在m／z 449［M＋H］＋、m／z 471［M＋Na］＋處給出準(zhǔn)分子離子峰，提示化合物分子量為448。結(jié)合氫譜、碳譜確定分子式為C27H28O6，不飽和度為14。該化合物的1H NMR數(shù)據(jù)能觀察到5組苯環(huán)氫信號(hào)（δ7．42，H－8；δ6．83，H－9；δ7．46，H－12；δ7．10，H－2’；δ6．38，H－5’），在高場(chǎng)區(qū)有2組重疊的甲基氫信號(hào)（δ1．63，H－16；δ1．63，H－10’；δ1．74，H－17；δ1．74，H－11’），2組亞甲基信號(hào)（δ28．3，C－13；δ27．9，C－7’），2組雙鍵氫信號(hào)（δ5．24，H－14；δ5．28，H－8’）綜合考慮為2個(gè)異戊烯基單元，從13C NMR以及DEPT譜中可觀察到分子中含有1個(gè)羰基碳信號(hào)（δ168．6，C－2），12個(gè)芳香碳信號(hào)以及3個(gè)次甲基信號(hào)（δ103．1，C－6；δ124．2，C－14；δ122．9，C－8’）。通過(guò)與已知化合物aspulvinone H（2）對(duì)比，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)化合物的A環(huán)部分核磁數(shù)據(jù)基本一致，主要差別在B環(huán)核磁數(shù)據(jù)的不同。在化合物2中B環(huán)有3個(gè)芳香氫，而化合物1中B環(huán)只有2個(gè)單峰的芳香氫（δ7．10，H－2；δ6．38，H－5），表明在化合物1中有1個(gè)芳香氫被羥基取代。仔細(xì)對(duì)比化合物1與2的13C NMR譜，發(fā)現(xiàn)化合物1比化合物2還多了1個(gè)化學(xué)位移值在δ154．2的與氧相連的芳香季碳，證明上述推斷的正確性。相對(duì)于化合物2，由于以上結(jié)構(gòu)中C－6’位羥基取代的影響，化合物1中C－3’和C－5’位碳的化學(xué)位移值都偏向了高場(chǎng)，而C－2’和C－6’位碳的化學(xué)位移值則稍微偏向了低場(chǎng)。化合物1的結(jié)構(gòu)信息雖然被SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，但是沒有相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)其報(bào)道，故命名為aspulvinone H1（1）。

化合物2，黃色油狀物。陽(yáng)離子ESI－MS在m／z433［M＋H］＋、［M＋Na］＋m／z455處給出準(zhǔn)分子離子峰，提示分子量為432。結(jié)合1H和13C NMR譜確定分子式為C27H28O5，不飽和度為14。該化合物的1H NMR數(shù)據(jù)能觀察到6組苯環(huán)氫信號(hào)（δ7．43，H－8；δ6．83，H－9；δ7．43，H－12；δ7．67，H－2’；δ6．87，H－5’；δ7．60，H－6’），為2個(gè)1，3，4－三取代苯環(huán)信號(hào)，在高場(chǎng)區(qū)有4個(gè)重疊的甲基氫信號(hào)（δ1．72，H－16；δ1．72，H－17；δ1．72，H－10’；δ1．72，H－11’），低場(chǎng)區(qū)有2個(gè)酚羥基氫信號(hào)（δ 9．5，OH；δ9．9，OH），2個(gè)雙鍵氫信號(hào)（δ5．29，H－14；δ5．29，H－8’）綜合考慮為2個(gè)異戊烯基單元，從13C NMR以及DEPT譜中可觀察到分子中含有1個(gè)羰基碳信號(hào)（δ168．6，C－2）和12個(gè)芳香碳信號(hào)以及2個(gè)亞甲基信號(hào)（δ28．3，C－13；δ28．6，C－7’），3個(gè)次甲基（δ108．1，C－6；δ123．3，C－14；δ122．8，C－8’）。根據(jù)以上信息經(jīng)過(guò)SciFinder檢索并且與文獻(xiàn)［11］數(shù)據(jù)對(duì)比，確定其結(jié)構(gòu)為aspulvinone H（2）。

化合物3，黃色油狀物。陽(yáng)離子ESI－MS在m／z 425［M＋H］＋、m／z 447［M＋Na］＋處給出準(zhǔn)分子離子峰，提示分子量為424。結(jié)合氫譜和碳譜數(shù)據(jù)確定分子式為C25H24O7，不飽和度為14。1H NMR譜中，在高場(chǎng)區(qū)觀測(cè)到1組甲基氫信號(hào)（δ1．65，H－16；δ1．70，H－17），1個(gè)亞甲基氫信號(hào)（δ3．14，H－13），此外還給出1個(gè)雙鍵氫信號(hào)（δ5．10，H－14），結(jié)合13C NMR數(shù)據(jù)（δ 29．2，C－13，δ121．4，C－14，δ134．5，C－15，δ25．7，C－17，δ17．7，C－16），提示分子中可能含有一個(gè)異戊烯基片段；δ6．53－δ7．63之間給出7個(gè)苯環(huán)氫信號(hào)，為1個(gè)1，3，4－三取代苯環(huán)，1個(gè)1，2－對(duì)位取代苯環(huán)的信號(hào)，從13C NMR以及DEPT譜中可觀察到分子中含有2個(gè)羰基碳信號(hào)（δ169．7，C－7’；δ169．5，C－2），12個(gè)芳香碳信號(hào)（其中2個(gè)芳碳與氧直接相連），此外還能發(fā)現(xiàn)1個(gè)羧基甲酯片段的信號(hào)（δ3．78，H－8’；δ169．7，C－7’），以上信息說(shuō)明該化合物也是丁內(nèi)酯類化合物，經(jīng)過(guò)SciFinder檢索并通過(guò)與文獻(xiàn)［12］數(shù)據(jù)對(duì)比確定其結(jié)構(gòu)為butyrolactone I（3）。

化合物4，淡黃色油狀物。陽(yáng)離子ESI－MS在m／z 155［M＋H］＋處給出準(zhǔn)分子離子峰，結(jié)合碳譜氫譜確定分子式為C8H10O3，不飽和度為4。該化合物的13C NMR譜中能觀察到1個(gè)羰基信號(hào)（δ203．6，C－1），4個(gè)雙鍵碳信號(hào)（δ168．4，C－3；δ139．3，C－6；δ125．5，C－2；δ124．7，C－7），1個(gè)甲基碳信號(hào)（δ19．1，C－8），2個(gè)連氧叔碳信號(hào)（δ76．3，C－4；δ80．7，C－5），說(shuō)明含有一個(gè)不飽和酮共軛系統(tǒng)。1H NMR譜中，觀測(cè)到2個(gè)羥基信號(hào)（δ3．89；δ4．50）。經(jīng)過(guò)SciFinder檢索并通過(guò)與文獻(xiàn)［13］數(shù)據(jù)對(duì)比確定其結(jié)構(gòu)為terrein（4）。

化合物5，淡黃色油狀物。陽(yáng)離子ESI－MS在m／z 153［M＋H］＋處給出準(zhǔn)分子離子峰，提示分子量為152。該化合物的1H NMR譜顯示了典型的1，2，3－三取代苯環(huán)的氫譜信號(hào)（δ7．1，H－5；δ6．73，H－4；δ6．7，H－6），和1個(gè)正丙基氫譜信號(hào)（δ2．53，H－7；δ1．54，H－8；δ 0．93，H－6）。綜合以上數(shù)據(jù)特點(diǎn)結(jié)合文獻(xiàn)［14］數(shù)據(jù)，確定該化合物為3－propylbenzene－1，2－diol（5）。

2．6 物理常數(shù)與波譜數(shù)據(jù)

化合物1：黃色油狀物，ESI－MS（positive）：m／z449．3［M＋H］＋，m／z 471．2［M＋Na］＋．［α］25D＝0．1（c＝0．1，MeOH）；UV（MeOH）λmax（logε）203（3．16），365（5．32）nm；IR（KBr）νmax3418，2917，2558，2421，1700，1695，1444，1076，1134，1111cm－11HNMR（600MHz，CDCl3）δ：1．63（6H，s，CH3－16，CH3－10′），1．74（6H，s，CH3－17，CH3－11′），3．10（2H，d，J＝7．2Hz，H－7′），3．22（2H，d，J＝7．4 Hz，H－13），5．24（1H，brd，J＝7．4Hz，H－14），5．28（1H，brd，J＝7．2Hz，H－8′），6．21（1H，s，H－6），6．38（1H，s，H－5′），6．83（1H，d，J＝10．2Hz，H－9），7．10（1H，s，H－2′），7．42（1H，d，J＝10．2 Hz，H－8），7．46（1H，brs，H－12）．13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：169．3（s，C－2），165．0（s，C－4），156．0（s，C－4′），155．7（s，C－10），154．2（s，C－6′），141．1（s，C－5），132．1（s，C－15），131．9（d，C－12），130．9（s，C－9′），130．5（d，C－2′），129．4（d，C－8），128．3（s，C－11），124．6（s，C－7），124．2（d，C－14），

122．9（d，C－8′），118．7（s，C－3′），115．7（d，C－9），108．1（s，C－1′），105．7（d，C－5′），103．1（d，C－6），98．1（s，C－3），27．9（t，C－7′），26．0（q，C－16），26．0（q，C－10′），28．3（t，C－13），18．1（q，C－17），18．0（q，C－11′）。

化合物2：黃色油狀物，ESI－MS（positive）：m／z433．4［M＋H］＋，m／z 455．1［M＋Na］＋。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：1．72（12H，s，CH3－16，CH3－17，CH3－10′，CH3－11’），3．20（2H，m，H－7′），3．22（2H，m，H－13），5．29（1H，m，H－14），5．29（1H，m，H－8′），6．55（1H，s，H－6），6．83（1H，d，J＝10．0Hz，H－9），6．87（1H，d，J＝9．7Hz，H－5′），7．43（1H，d，H－8），7．43（1H，s，H－12），7．67（1H，s，H－2′），7．60（1H，d，J＝9．7Hz，H－6′）。13C NMR（150MHz，CDCl3）δ：168．6（s，C－2），162．0（s，C－4），156．5（s，C－4′），154．6（s，C－10），140．4（s，C－5），132．3（s，C－15），132．1（d，C－12），131．7（s，C－9′），129．7（d，C－2′），129．0（d，C－8），128．5（s，C－3′），127．6（s，C－11），126．3（d，C－6′），124．4（s，C－1′），123．3（d，C－14），122．8（d，C－8′），121．2（s，C－7），115．9（d，C－5′），115．1（d，C－9），108．1（d，C－6），100．5（s，C－3），28．6（t，C－7′），28．3（t，C－13），26．0（q，C－10′），26．0（q，C－16），18．9（q，C－17），18．9（q，C－11′）。

化合物3：黃色油狀物，ESI－MS（positive）：m／z425．1［M＋H］＋，m／z 447．3［M＋Na］＋。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：1．65（3H，s，H－16），1．70（3H，s，H－17），3．14（2H，d，J＝7．3Hz，H－13），3．52（2H，dd，H－6），3．78（3H，s，H－8′），5．10（1H，m，H－14），6．53（1H，dd，J＝8．0，1．8Hz，H－9），6．51（1H，d，J＝1．8Hz，H－12），6．60（1H，d，J＝8．0 Hz，H－8），6．91（1H，d，J＝8．8Hz，H－3′），6．91（1H，d，J＝8．8Hz，H－5′），7．63（1H，d，J＝8．8 Hz，H－2′），7．63（1H，d，J＝8．8Hz，H－6′）。13C NMR（150MHz，CDCl3）δ：169．7（s，C－7′），169．5（s，C－2），156．5（s，C－4′），153．2（s，C－10），137．1（s，C－3），134．5（s，C－15），131．9（d，C－12），129．6（d，C－6′），129．6（d，C－2′），129．2（d，C－8），128．3（s，C－1′），126．2（s，C－7），124．6（s，C－11），122．3（s，C－4），121．4（d，C－14），116．0（d，C－3′），116．0（d，C－5′），115．2（d，C－9），86．0（s，C－5），53．7（q，C－8′），38．6（t，C－6），29．2（t，C－13），25．7（q，C－17），17．7（q，C－16）。

化合物4：淡黃色油狀物，ESI－MS（positive）：m／z 155．1［M＋H］＋，1HNMR（600MHz，DMSO－d6）：δ 6．72（1H，dq，J＝6．9，16．0Hz），6．36（1H，d，J＝16．0Hz），6．01（1H，s），5．82（1H，s，OH），5．70（1H，s，OH），4．50（1H，brs），3．89（1H，brs），1．80（3H，d，J＝6．9Hz）。13C NMR（150MHz，DMSO－d6）δ：203．6（s，C－1），168．4（s，C－3），139．3（d，C－6），125．5（d，C－2），124．7（d，C－7），80．7（d，C－5），76．3（d，C－4），19．1（q，C－8）。

化合物5：淡黃色油狀物，ESI－MS（positive）：m／z 153．2［M＋H］＋，1HNMR（600MHz，CDCl3）δ：7．10（1H，dd，J＝9．6，9．6Hz），6．73（1H，d，J＝9．6Hz），6．70（1H，d，J＝9．6Hz），4．80（2H，s，OH），2．53（2H，m，CH2），1．54（2H，m，CH2），0．93（3H，t，J＝6．9Hz）。

2．7 化合物抗腫瘤活性

采用MTT法初步評(píng)價(jià)了化合物1－5對(duì)人體慢性髓性白血病細(xì)胞K562、人肺腺癌A549細(xì)胞和人宮頸癌Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒活性（表2）。結(jié)果表明，在濃度為50μmol／L時(shí)，化合物4和5對(duì)K562、A549及Hela細(xì)胞都具有中等強(qiáng)度的活性。

3 結(jié)語(yǔ)

本文從紅樹林植物內(nèi)生真菌W－8的發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了5個(gè)化合物，包括3個(gè)α，β－不飽和丁內(nèi)酯類化合物（1－3），1個(gè)環(huán)戊酮類化合物（4），1個(gè)苯的衍生物（5）。文獻(xiàn)［15－16］報(bào)道這類丁內(nèi)酯類化合物主要來(lái)源于土曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物，且具有5－脂氧合酶抑制劑、依賴細(xì)胞周期素激酶的選擇性抑制劑、自由基清除劑、抗菌等多種活性，已經(jīng)引起了許多合成工作者的興趣［17］。但是本文在評(píng)價(jià)單體化合物的抗腫瘤活性中，化合物1－3并未表現(xiàn)出對(duì)A－549、K－562和Hela細(xì)胞株的活性，而化合物4、5均具有中等強(qiáng)度的細(xì)胞毒活性，為該菌的主要抗腫瘤活性成分。

［1］ Schulz B，Boyle C．What are endophytes？［M］．∥Sieber，T．N．Eds．，Microbial Root Endophytes．vol 1．Berlin；Springer－Verlag，2006：13．

［2］ Strobel G，Daisy B，Castillo U，Harper J．Natural products from endophytic microorganisms［J］．J Nat Prod，2004，67（2）：257－268．

［3］ Schulz B，Boyle C，Draeger S，et al．Endophytic fungi：a source of novel biologically active secondary metabolites［J］．Mycol．Res．，2002，106：996－1004．

［4］ Esser，K．Endophytic fungi，occurrence and metabolites［M］．∥Anke T，Weber D Eds．The Mycota：A comprehensive treatise on fungi as experimental systems for basic and applied research．Berlin；Springer－Verlag，2009：154－195．

［5］ Freeman S，Rodriguez R J．Genetic conversion of a fungal plant pathogen to a nonpathogenic，endophytic mutualist［J］．Science，1993，260：75－78．

［6］ Saikkonen K，F(xiàn)aeth S H，Helander M，et al．Fungal endophytes：a continuum of interactions with host plants［J］．Annu．Rev．Ecol．Syst．，1998，29：319－343．

［7］ Stierle A，Strobel G A，Stierle D．Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae，an endophytic fungus of Pacific Yew［J］．Science，1993，260：214－216．

［8］ 韓維凍，高秀梅，盧昌義，等．雷州半島的紅樹林植物組成與群落生態(tài)［J］．廣西植物，2003，02：007．

［9］ 林貞健．真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的化學(xué)多樣性開發(fā)及生物活性研究［D］．青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2006．

［10］ Mossman T．Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assay［J］．J Immunol Meth，1983，65（1－2）：55．

［11］ Bernier D，Br ckner R．Novel synthesis of naturally occurring pulvinones：a Heck coupling，transesterification，and dieckmann condensation strategy［J］．Synthesis，2007，15：2249－2272．

［12］ Kim B G，Kim J P，Kim W G，et al．Butyrolactone free－radical scavengers from Aspergillus sp．F80161［P］．Korean，KR 2002045053，2002－06－19．

［13］ Ghisalberti E L，Narbey M J，Rowland C Y．Metabolites of Aspergillus terreus Antagonistic towards the take－all fungus［J］．J Nat Prod，1990，53：520－522．

［14］ Gaudin J，Nikolaenko O，de Saint Laumer J，et al．Structure－Activity relationship in the domain of odorants having marine notes［J］．Helv Chim Acta，2007，90：1245－1265．

［15］ Begley，Michael J，Gedge，et al．Aspulvinones，a new class of natual products from Aspergillus terreus．Reinvestigation of structures by x－ray crystallographic and spectroscopic analysis［J］．JCS Perkin 1，1979，（1）：77－83．

［16］ Ojima，Nobutoshi，Takenaka，et al．Structures of pulvinone derivatives from Aspergillus terreus［J］．Phytochemistry（Elsevier），1975，14（2），573－576．

［17］ Bernier，David，Bruckner，et al．Novel synthesis of naturally occurring pulvinones：a Heck coupling，transesterification，and dieckmann condensation strategy［J］．Synthesis，2007，（15）：2249－2272

Antitumor Components from an Endophytic Fungus Aspergillus terreus（W－8）．Associated with Acanthus ilicifolius Linn．

SUN Shi－Wei，LIN Zhen－Jian，ZHU Tian－Jiao，LI De－Hai，GU Qian－Qun＊
（Key Laboratory of Marine Drugs，Chinese Ministry of Education，School of Medicine and Pharmacy，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

Fourteen active strains isolated from the leaves or branches of mangrove plants were screened using P388cell line（mouse leukemia cell line）．Five compounds from fungus W－8were isolated by solvent extraction，bioassay－guided fractionation，silica gel column chromatography，and preparative HPLC．By means of physicochemical properties and spectral analysis，they were identified as aspulvinone H1（1），aspulvinone H（2），butyrolactone I（3），terrein（4），and 3－propylbenzene－1，2－diol（5），respectively．The NMR data of compound 1were first reported here．Compounds 4 and 5 showed mediate cytotoxicities against A549，K562，and Hela cell lines．

mangrove plants；endophytic fungi；secondary metabolites；antitumor activity；Acanthus ilicifolius Linn．

R927

A

1672－5174（2011）05Ⅱ－349－07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30973627）；國(guó)家海洋局海洋公益性科研專項(xiàng)（2010418022－3）；山東省自然科學(xué)重點(diǎn)基金（ZR2009CZ016）；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20100132120026）資助。

2011－03－28；

2011－04－13

孫世偉（1986－），男，碩士生。E－mail：sunshiwei＿1986＠163．com

＊＊通訊作者：E－mail：guqianq＠ouc．edu．cn

責(zé)任編輯 徐 環(huán)