何娜娜，李 慧，王東輝，匡華琴，吳 敏，陳冬冬

(湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

道地藥材五鶴續(xù)斷是一種常用中藥，它是川續(xù)斷科植物川續(xù)斷(Dipsacusasperwall.)的干燥根，具有補(bǔ)肝益腎、續(xù)筋接骨、通血脈的功效.其性苦、辛、微溫，用于腰膝酸軟、風(fēng)濕 痛、崩漏經(jīng)多、胎漏下血、跌打損傷等.續(xù)斷中含有揮發(fā)油、生物堿、多糖、蛋白質(zhì)和多種重金屬離子等主要有效成分.五鶴續(xù)斷產(chǎn)量高，市場(chǎng)需求量大，臨床應(yīng)用范圍廣，開(kāi)發(fā)前景好，但目前續(xù)斷品種雜，不同產(chǎn)地的續(xù)斷形態(tài)差異較大[1]，因此很有必要對(duì)五鶴續(xù)斷進(jìn)行更深入的研究.

目前，對(duì)續(xù)斷植物的研究主要有品種考證[2]、栽培種植[3]、生物學(xué)特性[4]、藥理作用[5]、臨床應(yīng)用[6]、質(zhì)量辨別[7]、有效化學(xué)成分的分離[8]等.而同工酶分析技術(shù)廣泛應(yīng)用于中藥材親緣關(guān)系及道地性研究中[9].同工酶是指能催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其酶蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)組成卻有所不同的一組酶，是基因表達(dá)的直接產(chǎn)物，在很大程度上能反映植物個(gè)體的遺傳差異.同工酶結(jié)構(gòu)的相似性反映了生物間的親緣關(guān)系，酶譜資料可以作為鑒定物種，研究分類(lèi)、進(jìn)化、遺傳和變異的重要參數(shù)[10].其中過(guò)氧化物酶是由單基因決定的同工酶，具有物種、組織器官和發(fā)育階段的特異性，在一定程度上能較好的反映不同種源間的遺傳差異.超氧化物岐化酶是一種與氧環(huán)境有關(guān)、具有清除氧自由基能力的酶[11-12].故本試驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術(shù)，分離續(xù)斷葉片中過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶同工酶，比較電泳后的譜帶來(lái)分析不同產(chǎn)地續(xù)斷的親緣關(guān)系，為續(xù)斷植物的分類(lèi)、選育及遺傳研究提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

采自建始縣龍坪、利川市元堡、恩施市魚(yú)塘壩上壩、恩施市魚(yú)塘壩硒礦區(qū)、巴東縣綠蔥坡、恩施市雙河、鶴峰縣太平鄉(xiāng)、鶴峰縣五里坪地區(qū)8個(gè)產(chǎn)地的五鶴續(xù)斷.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平，DYY-10C型垂直電泳槽及電泳儀(北京六一儀器廠)，飛鴿牌GL-16G-II高速冷凍離心機(jī)(廠家)，SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(廠家).

表1 聚丙烯酰胺凝膠配制表

1.3 試劑的配制和準(zhǔn)備

1)30%Acr-0.8%Bis貯液：稱(chēng)取30 g丙烯酰胺(Acr)和0.8 g甲叉雙丙烯酰胺,置于洗凈烘干的燒杯中，加50 mL重蒸水溶解,攪拌,最后用重蒸水定容至100 mL，盛于棕色瓶中，在4℃冰箱中保存.

2)分離膠緩沖貯備液(3 mol/LTris-HCl pH8.8)：稱(chēng)取18.2 gTris，加40 mL重蒸餾水溶解，再用 1 mol/L HCl調(diào)至pH=8.8，然后定容至100 mL，盛于棕色瓶中，4℃保存.

3)濃縮膠緩沖貯備液(0.5 mol/L Tris-HCl pH6.8)：稱(chēng)取6.7 gTris，加30 mL重蒸餾水，再用1 mol/L HCl調(diào)至pH=6.8，然后定容至100 mL，盛于棕色瓶中，4℃保存.

4)10%的過(guò)硫酸銨(10%Ap)：稱(chēng)取0.5 g過(guò)硫酸銨溶于5 mL重蒸餾水.使用時(shí)現(xiàn)配現(xiàn)用.

5)電極緩沖液 (0.25 mol/LTris，1.92 mol/L甘氨酸，pH8.3)：稱(chēng)取3 gTris 和14.4 g甘氨酸溶解在50 mL蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.3，用重蒸餾水定容至1 000 mL ,盛于棕色瓶中，保存在4℃冰箱中備用.

6)樣品提取液A(0.05 mol/L Tris-HCl pH8.0)： 稱(chēng)取0.6 gTris，與30 mL 0.1 mol/L HCl混勻，調(diào)節(jié)pH值至8.0，加水稀釋至100 mL.

7)樣品提取液B(0.05 mol/L 磷酸緩沖液 pH7.8)：含1%PVP(聚乙烯吡咯烷酮).

8)樣品處理液(40%Gly-0.1%溴酚藍(lán)溶液):稱(chēng)取0.1 g溴酚藍(lán),甘油40 mL，加蒸餾水溶解，定容至100 mL，盛于棕色瓶中，保存在4℃冰箱中備用.

9)TEMED溶液：直接用原液.

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品處理 分別稱(chēng)取8個(gè)地區(qū)續(xù)斷新鮮葉片0.2 g，放入事先冰浴的研缽中，加入1 mL樣品緩沖液(POD同工酶樣品提取液用緩沖液A 0.05 mol/L Tris-HCl pH 8.0，SOD同工酶樣品提取液用樣品提取液B 0.05 mol/L 磷酸緩沖液 pH7.8).研磨后將勻漿全部轉(zhuǎn)入離心管，配平后放入4℃離心機(jī)10 000 r/min離心15 min，取上清液冷藏待用.

1.4.2 凝膠制備 分離膠制備經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)對(duì)比，確定濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度POD同工酶為9%，SOD同工酶為10%，配方如表1.

1.4.3 染色方法 POD同工酶采用醋酸聯(lián)苯胺法：稱(chēng)取0.1 g聯(lián)苯胺，加少量無(wú)水乙醇溶解，依次加5 mol/L HAc 10 mL，1.5 mol/L NaAc 10 mL，H2O 70 mL ，最后加入3～5滴H2O2.將此顯色液傾入培養(yǎng)皿中，待電泳凝膠片加入后不斷攪動(dòng).常溫下染色5 min，顯色完畢用蒸餾水清洗數(shù)次，7%醋酸固定.數(shù)碼相機(jī)照相.SOD同工酶的染色先將電泳好的凝膠浸入含有0.24 mmol/L NBT和0.28 mmol/L核黃素的pH7.8、50 mmol/L的磷酸緩沖液中，暗中反應(yīng)20 min；取出后再浸入含有28 mmol/L TEMED(Mr:116.2)的pH7.8、50 mmol/L的磷酸緩沖液中，光下(600Lx)顯色，直至凝膠上呈現(xiàn)出無(wú)色的SOD同工酶條帶時(shí)照相.

1.4.4 結(jié)果計(jì)算 酶帶遷移率(Rf)=酶帶遷移距離/溴酚藍(lán)遷移距離.

相似系數(shù)計(jì)算公式：S=2w/ (a+b).其中S為相似系數(shù)；w為2個(gè)品種相同的條帶數(shù)；a、b分別為2個(gè)品種各自的條帶數(shù).

聚類(lèi)分析：根據(jù)同工酶譜帶的遷移率(Rf)，利用NTSYS 2.10e軟件進(jìn)行計(jì)算，得到聚類(lèi)分析圖.

1，建始縣龍坪；2，利川市元堡；3，恩施市魚(yú)塘壩上壩；4，恩施市魚(yú)塘壩硒礦區(qū)；5，巴東縣綠蔥坡；6，恩施市雙河；7，鶴峰縣太平鄉(xiāng)；8，鶴峰縣五里坪.圖1 POD同工酶酶譜Fig.1 The map of POD isozymes

圖2 續(xù)斷聚類(lèi)分析圖(POD)Fig.2 Dendrogram by cluster analysis of Dipsacus asper

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地續(xù)斷的過(guò)氧化物酶酶譜分析

2.1.1 過(guò)氧化物酶POD電泳圖像 圖1中電泳圖譜分別代表了五鶴續(xù)斷根徑葉中POD同工酶譜帶，不同產(chǎn)地續(xù)斷的酶帶各有不同.供試材料共顯示出5條譜帶，從負(fù)極到正極依次編號(hào)為Rf1～Rf5.Rf值在0.35～0.55之間，其中Rf2為除了5號(hào)材料外，其他材料共有的譜帶，可作為續(xù)斷在過(guò)氧化物同工酶譜上的特征酶帶.在8份供試材料中，1號(hào)(建始縣龍坪)和3號(hào)(恩施市魚(yú)塘壩上壩)所顯示的酶譜完全相同且酶帶最多，有4條；5號(hào)(巴東縣綠蔥坡)所顯示的酶帶最少，僅有1條.

2.1.2 相似系數(shù)分析 計(jì)算不同產(chǎn)地續(xù)斷過(guò)氧化物酶酶帶遷移率(Rf)，結(jié)果如表3；以及8個(gè)不同續(xù)斷產(chǎn)地類(lèi)型酶譜間相似系數(shù)，結(jié)果如表4.

表3 8個(gè)產(chǎn)地續(xù)斷過(guò)氧化物酶同工酶酶譜Rf值

Tab.3Rfvalues of peroxidese isozeymes ofDipsacusfrom eight origins

樣品編號(hào)Rf1Rf2Rf3Rf4Rf510．3500．405—0．4550．5502—0．405———30．3500．405—0．4550．55040．3500．405—0．455—5——0．445——6—0．405———70．3500．405—0．455—8—0．4050．445——

表4 8個(gè)不同品種續(xù)斷酶譜間相似系數(shù)(POD)

Tab.4 Similar coefficient of isoenzyme bands ofDipsacusasperin eight

品種編號(hào)1234567811．00020．4001．00031．0000．4001．00040．8570．50．8571．000500001．00060．4001．0000．4000．50001．00070．8570．5000．8571．00000．5001．00080．3330．6670．3330．4000．6670．6670．4001．00

由表4可見(jiàn)，8份供試材料相似系數(shù)最大的為1(1號(hào)和3號(hào)；2號(hào)和6號(hào)；4號(hào)和7號(hào))；相似系數(shù)最小的為0.相似度越大，說(shuō)明物種間的酶譜差異越小，物種間關(guān)系越密切，反之則說(shuō)明差異越大.5號(hào)除了與8號(hào)的相似系數(shù)為0.667，與其他材料的相似系數(shù)都為0，說(shuō)明了5號(hào)(巴東縣綠蔥坡)與其他地區(qū)續(xù)斷差異性最大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn).

2.1.3 遺傳距離及聚類(lèi)分析 根據(jù)相似系數(shù)的聚類(lèi)結(jié)果表明，在聚類(lèi)距離0.680左右，8份續(xù)斷材料可以分為3大類(lèi).第一大類(lèi)包括建始縣龍坪、恩施市魚(yú)塘壩上壩、恩施市魚(yú)塘壩硒礦區(qū)、鶴峰縣太平鄉(xiāng)；第二大類(lèi)包括利川市元堡、恩施市雙河、鶴峰縣五里坪；第三類(lèi)只包括巴東縣綠蔥坡的材料.說(shuō)明了巴東縣綠蔥坡的續(xù)斷材料與其他地區(qū)的差異性最大.

2.2 不同產(chǎn)地續(xù)斷的超氧化物酶酶譜分析

2.2.1 超氧化物的SOD電泳圖譜 圖3中電泳圖譜分別代表了五鶴續(xù)斷SOD同工酶譜帶，不同產(chǎn)地續(xù)斷的酶帶各有不同.供試材料共顯示出4條譜帶，依次編號(hào)為Rf1～Rf4.Rf值在0.167～0.667之間.2號(hào)、3號(hào)、4和5號(hào)材料的譜帶都為2條，Rf值較為接近.6號(hào)、7號(hào)和8號(hào)材料的譜帶都為4條，1號(hào)材料為3條譜帶.

圖4 續(xù)斷聚類(lèi)分析圖(SOD)Fig.4 Dendrogram by cluster analysis of Dipsacus asper

1，鶴峰縣五里坪；2，利川市元堡；3，恩施市雙河；4，建始縣龍坪；5，恩施市魚(yú)塘壩硒礦區(qū)；6，鶴峰縣太平鄉(xiāng)；7，巴東縣綠蔥坡；8，恩施市魚(yú)塘壩上壩.圖3 SOD同工酶酶譜Fig.3 The map of SOD isozymes

2.2.2 相似系數(shù) 計(jì)算不同產(chǎn)地續(xù)斷超氧化物岐化酶的Rf值，如表6.據(jù)表6 Rf值計(jì)算再得酶譜間相似系數(shù),如表7.

表6 8個(gè)產(chǎn)地續(xù)斷超氧化物歧化酶同工酶酶譜Rf值

Tab.6Rfvalues of superoxide isozymes ofDispacusfrom eight origins

樣品編號(hào)Rf1Rf2Rf3Rf410．1670．450—0．6002—0．433—0．6333—0．467—0．6334—0．467—0．6335—0．467—0．66760．2670．4330．5330．63370．3000．4330．5000．60080．3000．4330．5000．567

表7 8個(gè)不同品種續(xù)斷酶譜間相似系數(shù)(SOD)

Tab.7 Similar coefficient of isoenzyme bands ofDipsacusasperin eight different regions

品種編號(hào)1234567811．00020．4001．00030．4001．0001．00040．4001．0001．0001．00050．4001．0001．0001．0001．00060．8560．6670．6670．6670．6671．00070．8560．6670．6670．6670．6671．0001．00080．8560．6670．6670．6670．6671．0001．0001．000

由相似系數(shù)可知，2、3、4、5號(hào)之間相似系數(shù)都為1.000，說(shuō)明它們的親緣關(guān)系很接近.6、7、8號(hào)之間相似系數(shù)也為1.000，它們的親緣關(guān)系也很接近.

2.2.3 遺傳距離及聚類(lèi)分析 根據(jù)相似系數(shù)的聚類(lèi)結(jié)果表明，在聚類(lèi)距離0.560左右，8份續(xù)斷材料可以分為四大類(lèi).第一類(lèi)只有鶴峰縣五里坪的續(xù)斷；第二類(lèi)包括利川市元堡、恩施市雙河、建始縣龍坪、恩施市魚(yú)塘壩硒礦區(qū)的續(xù)斷；第三類(lèi)只有鶴峰縣太平鄉(xiāng)的續(xù)斷；第四類(lèi)包括巴東縣綠蔥坡和恩施市魚(yú)塘壩上壩的續(xù)斷.

3 結(jié)論與討論

同工酶是由基因決定的，同工酶譜帶的差別能夠反映不同地區(qū)續(xù)斷間遺傳基礎(chǔ)的相互聯(lián)系與差異.恩施州8個(gè)產(chǎn)地續(xù)斷的過(guò)氧化物同工酶酶譜條帶數(shù)目最多4條，最少1條，除了巴東縣綠蔥坡地區(qū)的沒(méi)有第二條譜帶以外，其他7個(gè)地區(qū)的都有第二條譜帶.超氧化物歧化酶譜條帶數(shù)目最多4條，最少2條，并且都有第二條和第四條譜帶，說(shuō)明各地區(qū)五鶴續(xù)斷有著共同的遺傳基礎(chǔ).比較兩種酶的聚類(lèi)分析結(jié)果可以看出，利川市元堡和恩施市雙河地區(qū)的續(xù)斷親緣關(guān)系很近，鶴峰縣太平鄉(xiāng)和恩施市魚(yú)塘壩上壩地區(qū)的續(xù)斷親緣關(guān)系很近.巴東縣綠蔥坡與其他地區(qū)的差異較大，可能是由于巴東與其他地區(qū)氣候差異較大，該產(chǎn)區(qū)的續(xù)斷發(fā)生了基因突變.

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