陳永芳 劉思全 王立國 賈瑞寶

(1.濟南大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，濟南 250022； 2.濟南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，濟南 250022； 3.濟南市供排水監(jiān)測中心，濟南 250021)

近年來，隨著我國水體的富營養(yǎng)化程度逐漸加劇，藍藻水華和赤潮的發(fā)生逐漸增加。80%的藍藻水華都可以檢測出次生代謝產(chǎn)物——微囊藻毒素(microcystins，MCs)，它對水體環(huán)境和人群健康的危害已成為全球關(guān)注的重大環(huán)境問題之一[1]。

微囊藻毒素為七肽單環(huán)肝毒素[2]，結(jié)構(gòu)中存在著環(huán)狀結(jié)構(gòu)和間隔雙鍵，因而具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。它能夠強烈抑制蛋白磷酸酶的活性[3]，當(dāng)細(xì)胞破裂或衰老時毒素釋放進入水中[4,5]，同時它還是強烈的肝臟腫瘤促進劑[6]。因此微囊藻毒素異構(gòu)體的分離與表征對于分析藍藻水華對水體污染的影響具有重要的作用。

筆者以甲醇-水為提取溶劑對藍藻進行粗提，利用固相萃取手段對微囊藻毒素粗品進行初步純化與除雜后用高效液相色譜成功分離了微囊藻毒素異構(gòu)體。使用HPLC-MS對微囊藻毒素的主要3種異構(gòu)體進行了表征。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1100型，美國安捷倫科技有限公司；

HPLC-MS聯(lián)用儀：美國熱電公司；

離心機：TGL-16C型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

C18固相萃取小柱：容量6 mL，填充500 mg，天津博納艾杰爾科技有限公司；

甲醇：色譜純，山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司，使用時與水配制成不同的比例；

乙腈：分析純，上?；瘜W(xué)試劑研究所，使用時與水配制成不同的比例；

三氟乙酸：化學(xué)純，上?；瘜W(xué)試劑公司；

微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品-LR：美國sigma 公司；

微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品-RR：美國sigma 公司；

亞沸蒸餾水：用SYZ-550型石英亞沸高純水蒸餾器制備。

1.2 實驗方法

(1)粗提：首先將從云南滇池得到的藍藻離心，然后按一定的比例加入20%～65%的甲醇水溶液，室溫下磁力攪拌，超聲震蕩，以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心，取出上清液；殘渣重復(fù)萃取兩次，合并上清液；將提取液過0.45 μm的微濾膜，除去大分子雜質(zhì)，得微囊藻毒素粗品。

(2)純化與富集：將粗品通過ODS C18反相萃取柱，依次用10 mL 100%甲醇、10mL超純水活化萃取柱，再將粗提液以1 mL/min的流速流經(jīng)固相萃取柱進行富集濃縮，而后用一定濃度的甲醇淋洗。收集洗脫液，于30℃條件下濃縮至1 mL。

(3)分離：采用高效液相色譜法。色譜條件：Kromasil C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，12 nm)；流動相：甲醇-水溶液、乙腈-水溶液(三氟乙酸緩沖溶液)；柱溫：室溫；檢測波長238 nm；流速：0.5 mL/min；進樣量：2～10 μL；保留時間定性。

(4)表征：高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)。質(zhì)譜條件：噴霧電壓：4.5 kV；聚焦電壓：220 kV；入口電壓：12 V；離子源溫度：215℃；錐孔電壓：30 V；掃描范圍：m/z75～1 300。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取與預(yù)純化

(1)萃?。何墨I[7]報道了在藍藻中提取微囊藻毒素的方法，主要是用50%～90%的甲醇溶液進行萃取，通過實驗探討，發(fā)現(xiàn)65%的甲醇溶液提取效果最好，可最大程度提取出藍藻細(xì)胞內(nèi)外的微囊藻毒素。

(2)預(yù)純化：將微囊藻毒素粗品通過0.45 μm的微濾膜，除去大分子物質(zhì)以及纖維等雜質(zhì)，然后采用反相C18固相萃取柱進一步除雜與初步純化。通過探討發(fā)現(xiàn)，甲醇濃度越大，除雜效果越好，但當(dāng)增大到一定濃度時，微囊藻毒素也會相應(yīng)越多的洗脫出來，因此采用40%甲醇淋洗，70%甲醇洗脫可達到較好的效果。

2.2 高效液相色譜分離

文獻[8-11]報道對微囊藻毒素異構(gòu)體的分離主要采取反相高效液相色譜法，不同流動相對藻毒素的分離效果影響較大。筆者主要探討了不同比例的甲醇-水體系、乙腈-水體系和乙腈-水-0.01%三氟乙酸體系對微囊藻毒素異構(gòu)體的分離效果。

實驗結(jié)果表明：不同比例的甲醇-水體系對分離結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)80%的甲醇-水作為流動相時，分離結(jié)果較好，但微囊藻毒素的各異構(gòu)體仍然不能完全分開，這與文獻報道有明顯的區(qū)別；乙腈-水體系表現(xiàn)出與甲醇-水類似的規(guī)律，提高流動相中有機溶劑比例，微囊藻毒素出峰較早，尤其對于早出峰的MC-YR分析干擾較大，而體積分?jǐn)?shù)降低時，MC-LR出峰則較遲且峰形較差，通過對比發(fā)現(xiàn)采用80%的乙腈作為流動相，分離效果較好；而在乙腈-水體系中加入0.01%三氟乙酸時，并沒出現(xiàn)如文獻報道的更好分離效果。

將滇池藍藻提取物色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在同樣色譜條件下得到的色譜圖對照，比較各異構(gòu)體的保留時間，初步判定滇池藍藻中含有微囊藻毒素的3種主要異構(gòu)體，即MC-YR 3.335 min, MC-RR 4.679 min和MC-LR 7.37 min。

2.3 高效液相色譜-質(zhì)譜表征

對所得的微囊藻毒素異構(gòu)體進行HPLC-MS表征，其總離子流圖及保留時間為4.85 min的組分質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 微囊藻毒素異構(gòu)體HPLC-MS圖

由圖1可以看出，保留時間為4.85 min的組分一級質(zhì)譜圖m/z996.17為[M+H]+母離子峰，而MC-LR的分子量為995.17，其它碎片峰也與文獻報道的MC-LR碎片峰相符。

同樣，在總離子流圖中保留時間為4.54 min和5.28 min對應(yīng)的離子峰分別為m/z1 039.2和1 046.18為[M+H]+母離子峰，判斷出為微囊藻毒素異構(gòu)體MC-YR和MC-RR。

3 結(jié)論

考查了微囊藻毒素異構(gòu)體提取與純化的條件，以及高相液相色譜中流動相種類和比例對藻毒素異構(gòu)體分離結(jié)果的影響，結(jié)果表明：65%甲醇溶液提取效果較好，采用80%乙腈-水體系作為流動相得到了較好的分離效果。采用HPLC-MS對微囊藻毒素主要3種異構(gòu)體進行表征。目前,HPLC方法雖然是制備微囊藻毒素純品的最實用方法，但仍存在制備量較小、制備成本較高的問題。隨著微囊藻毒素需求量的增加，對微囊藻毒素的提取與純化方法需進行進一步的研究，以尋求更高效的制備、純化技術(shù)來提取更大量的微囊藻毒素純品。

[1] 盛建武，何苗，施漢昌，等．藍藻毒素的監(jiān)測及水華暴發(fā)的應(yīng)急方案[J]．中國給水排水， 2005，21(5)：26-28．

[2] 李祝，盧蒙，朱遲，等．微囊藻毒素的提取與純化研究進展[J]．華中師范大學(xué)研究生學(xué)報，2004，11(2)：115-119．

[3] 林毅雄，劉秀芬．滇池銅綠微囊藻毒素及其在水體中的變化[J]．環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2001，2(5)：10-13．

[4] 戴瑾瑾，陳德輝，高云芳，等．藍藻毒素的研究概況[J]．武漢植物學(xué)研究，2009，27(1)：90-97．

[5] 張立將，尹立紅，浦躍樸，等．水中微囊藻毒素高效液相色譜檢測與前處理條件優(yōu)化[J]．東南大學(xué)學(xué)報，2005，35(3)：446-451．

[6] 熬宗華，湯曉智，劉萍，等．藍藻中生物活性物質(zhì)的研究概況[J]．藥物生物技術(shù)，2001，8 (5)：296-300．

[7] Lawton L A， Edwards C．Purification of microcystins[J]. J of Chromatography，2001，912：191 -209．

[8] Ikawa M， Phillips N， Haney J F， et al． Interference by plastics additives in the HPLC determination of microcystin-LR and -YR[J]. Toxicon，1999，37(6)：923-929．

[9] 區(qū)暉，周志洪，吳清柱．高效液相色譜法測定地表水中微囊藻毒素-LR[J]．廣州環(huán)境科學(xué)，2009，24(1)：25-26．

[10] 陳曉國，楊力力，肖邦定，等．微囊藻毒素[Dha7]MCRR的制備及鑒定[J]．環(huán)境科學(xué)，2007，18(9)：2 063-2 067．

[11] 趙永剛，胡冠九，章勇，等．固相萃取高效液相色譜法測定地表水中微囊藻毒素[J]．理化檢驗:化學(xué)分冊，2008，44(12)：1 176-1 179．