劉曉慧 呂慶鑾 王懷友

(山東師范大學實驗室管理處，濟南 250014) (魯南煤化工研究院，濟寧 272000) (山東師范大學化學化工與材料科學學院,濟南 250014)

蘆丁(又名維生素P)是一種分布廣泛的黃酮類化合物，存在于槐米、蕓香葉、煙葉、棗、杏、橙皮、番茄等物質中。蘆丁具有降低毛細管的通透性和脆性，改善微循環(huán)的作用，還可作為抗氧劑和天然食用黃色素[1]，在臨床上主要用于糖尿病、高血壓的輔助治療[2]。蘆丁除了在食品工業(yè)中可作保健品外，在化妝品行業(yè)，蘆丁是目前較為理想的一種天然廣譜防曬劑[3]。

蘆丁的測定方法主要有電化學發(fā)光法[4]、熒光光度法[5]、分光光度法[6]、高效液相色譜法[7]，毛細管電泳法[8]等。蘆丁本身熒光很弱，因此分析工作者采用敏化蘆丁熒光的方法對其測定。目前，熒光探針猝滅法測定蘆丁還未見報道。羅丹明6G(Rhodamine 6G，Rh6G)是一種水溶性陽離子熒光染料，在水中可發(fā)強綠色熒光，光穩(wěn)定性好，對pH不敏感，Stokes位移大，熒光量子產率高等，因而被廣泛用于熒光標記或定量分析[9]。筆者研究發(fā)現(xiàn)蘆丁對羅丹明6G的熒光具有顯著猝滅作用，并確定了熒光猝滅類型，據(jù)此建立了測定蘆丁的新方法。該方法簡便、快速、靈敏度高，用于片劑中蘆丁含量的測定，結果滿意。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

熒光分光光度計：LS-50型，美國Perkin-Elmer公司；

紫外可見分光光度計：UV-265型，日本島津公司；

酸度計：pHS-3C型，上海雷磁儀器廠；

超純水系統(tǒng)：Direct-Q3型，美國Millipore公司；

羅丹明6G儲備液：1.0 mg/mL，上海國藥化學試劑有限公司，臨用前用水稀釋100倍；

蘆丁標準溶液：1.0 mg/mL，準確稱取100.0 mg蘆丁(BR，北京化學試劑公司)，溶于適量無水乙醇中，移入100 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，混勻；

蘆丁片：購于藥店；

Na2HPO4-KH2PO4緩沖液：pH 5.29，將Na2HPO4(1/15 mol/L)和KH2PO4(1/15 mol/L)以體積比5∶95混合均勻;

除特別注明，實驗所用其它試劑均為分析純；

實驗用水為超純水，電阻率不小于18.2 MΩ·cm。

1.2 實驗方法

(1)步驟Ⅰ

取不同濃度的蘆丁溶液于10 mL比色管中，依次加入pH 5.29的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液1.0 mL，10 mg/L羅丹明6G溶液0.1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，放置30 min后于熒光分光光度計上，以λex338 nm、λem540 nm進行掃描，記錄熒光發(fā)射光譜。激發(fā)和發(fā)射狹縫皆為15 nm，掃描速度為500 nm/min。

(2)步驟Ⅱ

于10 mL比色管中，依次加入pH 5.29的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液1.0 mL，10 mg/L羅丹明6G溶液0.1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，記作溶液A；加入不同濃度的蘆丁溶液于另一10 mL比色管中，再按照上述試劑量依次加入，定容搖勻，記作溶液B；另一10 mL比色管中，以1.0 mL 1.0 mg/mL的蘆丁溶液代替溶液A中的羅丹明6G溶液，定容搖勻，記作溶液C。以水為參比，在紫外可見分光光度計上繪制其吸收光譜，狹縫寬度為2 nm。

1.3 樣品溶液的制備

取本品5片，研細，準確稱取細粉50 mg，加無水乙醇使之溶解, 轉移至50 mL 容量瓶中，定容，過濾，作為待測液。

2 結果與討論

2.1 熒光光譜

按照分析步驟Ⅰ，分別繪制在蘆丁(濃度為10 μg/mL)存在和不存在下羅丹明6G的熒光光譜，結果見圖1。

a、b—分別為羅丹明6G的激發(fā)和發(fā)射光譜；c、d—分別為加入蘆丁后羅丹明6G的激發(fā)和發(fā)射光譜圖1 羅丹明6G的激發(fā)和發(fā)射光譜

2.2 熒光猝滅機理探討

實驗表明，蘆丁對羅丹明6G的熒光有猝滅作用。猝滅機理分為靜態(tài)猝滅、動態(tài)猝滅和靜態(tài)動態(tài)混合猝滅[10]；靜態(tài)和動態(tài)猝滅Stern-Volmer曲線的特征都是直線，混合猝滅Stern-Volmer曲線的特征是向上彎曲的非線性關系[11]。為了確定熒光猝滅機理的類型，進行了熒光猝滅實驗。按照實驗步驟Ⅰ，測定F0及F的值(F、F0分別為猝滅劑存在和不存在下羅丹明6G的相對熒光強度)，得到Stern-Volmer圖，如圖2所示。由圖2可知，Stern-Volmer圖為線性，所以蘆丁對羅丹明6G的熒光猝滅機理不是靜態(tài)動態(tài)混合猝滅。

圖2 F0/F與猝滅劑濃度的關系

區(qū)分動態(tài)和靜態(tài)猝滅的方法可以用熒光物質在猝滅劑不存在和存在時吸收光譜的變化。通常發(fā)生靜態(tài)猝滅形成了非熒光化合物，會引起熒光物質吸收光譜的變化[10]。按照步驟Ⅱ，掃描羅丹明6G在蘆丁存在和不存在下的吸收光譜，結果見圖3。由圖3可見，加入蘆丁后，羅丹明6G的吸收光譜發(fā)生紅移，并隨著蘆丁濃度的增大，紅移越顯著，表明蘆丁與羅丹明6G發(fā)生了作用，形成了復合物。故二者之間的猝滅類型為靜態(tài)猝滅。

1～6—蘆丁濃度分別為0、20、40、60、80、100 μg/mL； 7—蘆丁圖3 羅丹明6G加入不同濃度的蘆丁后的吸收光譜

對于靜態(tài)猝滅反應，如果假定在分子中有相似的且不相關的結合點，那么熒光強度和猝滅介質之間可推斷出式(1)[10]：

nQ+B→Qn+B

(1)

B是有熒光的染料分子，Q是具有猝滅作用的分子，Qn+B是猝滅的分子，其形成常數(shù)K可用式(2)表示：

(2)

如果染料分子的總濃度(包括游離的和與猝滅分子反應的)是[B]0，則[B]0= [Qn+B]+[B]，[B]是未反應的染料分子的濃度，那么熒光強度與未反應的分子的濃度之間的關系是[B]/[B]0=F/F0，則有：

lg[(F0-F)/F]=lgK+nlg[Q]

(3)

K是蘆丁與羅丹明6G的結合常數(shù)，可通過lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作圖(見圖4)。從公式(3)可得，斜率為n，截距為lgK，由此可得蘆丁與羅丹明6G的結合常數(shù)K=5.55×105L/mol，結合點數(shù)n=1.26，相關系數(shù)r=0.998 7。

圖4 lg[(F0-F)/F]與lg[Q]的關系

2.3 實驗條件優(yōu)化

(1)酸度

蘆丁在堿性條件下會變成金黃色，實驗中發(fā)現(xiàn)，當pH>6.5時就變色，所以實驗了pH在2.0～6.5間的影響。當pH在5.0～5.5間時熒光猝滅最大，因此選擇pH 5.29的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液控制體系酸度，并且發(fā)現(xiàn)1.0 mL為最佳用量。

(2)試劑加入順序

實驗了3種反應物的6種加入順序，結果表明最佳加入順序為蘆丁、緩沖液、羅丹明6G。

(3)放置時間

按照分析步驟Ⅰ，每5 min 測定體系相對熒光強度。實驗發(fā)現(xiàn)，在30 min內體系相對熒光強度略有下降，隨后不再變化，且于室溫下至少穩(wěn)定3 h。故選擇最佳放置時間為30 min。

2.4 共存物質的干擾試驗

2.5 工作曲線

在所選實驗條件下，蘆丁的濃度在0.92～137.8 μg/mL范圍內與F0/F呈良好的線性關系，線性回歸方程為F0/F=0.802+0.0797c，相關系數(shù)為0.999 6。F0和F分別為蘆丁不存在和存在下的羅丹明6G的熒光強度。

2.6 精密度和檢出限

按照分析步驟，將同一樣品測定11次，測得待測液中蘆丁的平均含量為434.4 μg/mL，相對標準偏差為0.45%。檢出限為0.90 μg/mL。

2.7 樣品測定

取一定量蘆丁溶液，按實驗方法進行測定，其結果與UV法[8]一致，測定結果見表1。置信度為95%時，用Cochran檢驗[12]，兩種方法間不存在顯著性差異。

表1 本法與UV法測定結果的比對(n=3)

2.8 回收試驗

用標準加入法進行了回收試驗，結果見表2。由表2可知，蘆丁的回收率為92.4%～96.3%，說明該方法準確可靠，因此該方法可用于蘆丁片的測定。

表2 蘆丁片回收試驗結果(n=3)

3 結語

以羅丹明6G為熒光探針測定了蘆丁含量，結果表明方法具有較高的靈敏度,對蘆丁的檢出限為0.90 μg/mL；測定結果與UV法測定結果相符合，該法可用于蘆丁片劑含量的測定。

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