顧 雯,金 聰,張 碩,張全福,李建東 ,杭小同 ,王 芹,李 川,梁米芳,李德新

登革病毒(dengue viruses,DENV)屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus),是一類嚴(yán)重危害人類健康的蟲媒病毒。據(jù)統(tǒng)計,全世界有超過25億的人口處于登革病毒的威脅之中,登革病毒感染已經(jīng)成為嚴(yán)重的世界性公共衛(wèi)生問題[1]。登革病毒根據(jù)抗原性不同分為4個血清型(DENV1～4),不同血清型刺激機體產(chǎn)生無保護性作用的交叉抗體及ADE作用,給疫苗的研制帶來了極大的挑戰(zhàn),目前全世界范圍內(nèi)尚無被批準(zhǔn)的安全有效的疫苗。

登革病毒為單正鏈RNA病毒,基因組長約ll kb,含單一開放讀碼框,依次編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM和 E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和 NS5)[2]。其中 E蛋白為DENV的主要包膜糖蛋白,是重要的抗原成份,也是登革病毒分型的依據(jù)。prM蛋白是M蛋白的前體,是形成病毒顆粒的重要膜蛋白并且有助于 E蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,NS1蛋白是登革病毒重要的非結(jié)構(gòu)蛋白。

2009年7月,浙江省義烏市暴發(fā)了登革熱疫情,經(jīng)實驗室診斷為登革3型病毒感染所致[3]。本研究對2009年登革3型病毒義烏流行株進行E基因及NS1基因的系統(tǒng)進化分析,構(gòu)建該流行株prM/E基因重組質(zhì)粒,獲得分泌表達(dá)的E蛋白并對其免疫原性進行初步研究,為登革病毒診斷抗原的制備及登革疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、毒株及抗體 293T細(xì)胞及BHK-21細(xì)胞由美國ATCC引進;DENV-3義烏分離株由浙江省疾控中心惠贈;DENV1-4型國際標(biāo)準(zhǔn)株(DENV-1 Hawaii株,DENV-2 NGC株,DENV-3 H87株及DENV-4 H241株)由本室保存。FITC標(biāo)記的抗兔IgG抗體購自Sigma公司;HRP標(biāo)記的抗兔IgG抗體購自Snata Cruz公司;DENV-3 EⅢ蛋白兔免疫血清、DENV 1-4 EIII蛋白(分別表達(dá)DENV1-4國際標(biāo)準(zhǔn)株的EⅢ蛋白)由本室制備。

1.2 序列測定及系統(tǒng)進化分析 病毒RNA提取采用德國Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini kit,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后利用設(shè)計的28對引物擴增全基因組相應(yīng)區(qū)段,序列測定后經(jīng)拼接獲得全基因組序列。利用MEGA4將其與 GenBank中檢索到的其它14株登革3型病毒進行E及NS1區(qū)段核苷酸及氨基酸序列比對和同源性分析,Neighbor-joining(NJ)法建立系統(tǒng)發(fā)生樹,并用Bootstrap值為1 000評價系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.3 E蛋白的分泌表達(dá) 設(shè)計引物擴增DENV-3義烏分離株prM/E基因,通過融合 PCR方法在prM基因前添加一段來源于乙腦病毒的信號肽序列并將E基因C端的20%區(qū)域替換為乙腦病毒相應(yīng)序列?；蚱谓?jīng)N heI、NotI雙酶切后克隆至pcDNA5/FRT載體中,重組質(zhì)粒命名為J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5。利用羅氏公司 Fu-GENE HD Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集上清。IFA及Western Blot方法分別檢測E蛋白在胞內(nèi)的表達(dá)及胞外的分泌情況,以DENV-3 EⅢ蛋白兔免疫血清(1∶200稀釋)及登革病人血清(1∶50稀釋)為一抗,FITC標(biāo)記的抗兔IgG(1∶100稀釋)或 HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG抗體 (1∶3 000稀釋)為二抗,按常規(guī) IFA及 Western Blot操作步驟進行檢測。

1.4 分泌性E蛋白的免疫原性研究

1.4.1 BALB/c小鼠免疫實驗 將 4-6w齡BALB/c雌性小鼠(由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實驗動物研究所提供)隨機分為 2組(5只/組),即實驗組(DENV-3 YW E蛋白組)及對照組(PBS組)。蔗糖密度梯度離心純化后的DENV-3 E蛋白及PBS分別與等體積的弗氏佐劑(初次免疫為弗氏完全佐劑,加強免疫為弗氏不完全佐劑)充分乳化后于第0、14、28d進行腹腔接種,免疫劑量為 100μg/只。末次免疫兩周后小鼠摘除眼球取血,分離血清備用。

1.4.2 ELISA檢測血清抗DENV 1-4 EIII蛋白抗體 以原核表達(dá)純化的DENV 1-4型EⅢ蛋白為抗原包被酶標(biāo)板。每只小鼠血清從1∶50起作2倍系列稀釋,37℃孵育1h。加入1∶1 000稀釋的 HRP標(biāo)記抗鼠IgG,37℃1h,顯色并終止。酶標(biāo)儀檢測吸光度A450值。以PBS組各稀釋度A450值為陰性對照,根據(jù)Cutoff為 P/N>2.1的標(biāo)準(zhǔn),選擇符合該標(biāo)準(zhǔn)的最大稀釋度作為每份血清的滴度并進行對數(shù)轉(zhuǎn)換。

1.4.3 微量細(xì)胞病變中和試驗檢測血清中和活性將BHK-21細(xì)胞傳代至96孔板,待細(xì)胞長至單層。將滅活后的血清從1∶5起作2倍系列稀釋,分別與100TCID50的DENV1-4病毒國際標(biāo)準(zhǔn)株按1∶1混合,37℃溫育1h后加入細(xì)胞表面,每個稀釋度作4個復(fù)孔。37℃,5%CO2培養(yǎng),7d后觀察細(xì)胞病變。以4個復(fù)孔均不出現(xiàn)可觀察到的細(xì)胞病變的血清稀釋度作為抗體中和效價。

2 結(jié) 果

2.1 DENV-3義烏分離株全基因組序列測定及系統(tǒng)進化分析 登革3型病毒義烏分離株基因組全長共10,685nt,含單一的開放讀碼框(95-10 267 nt),共編碼3391個氨基酸。利用登革病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白E及非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的核苷酸和氨基酸序列分別建樹,結(jié)果見圖1。義烏分離株屬于登革3型病毒亞型 Ⅲ,與 2009年廣州 GZ1D3株 (GB:GU363549)相似度最高,E基因、NS1基因核苷酸同源性分別為99.7%、99.4%,氨基酸同源性分別為99.8%、99.1%;與 2003年印度 GWL-25株(GB:A Y770511)E基因、NS1基因核苷酸同源性分別為 98.8%、98.5%,氨基酸同源性分別為99.8%、99.1%。與同分為亞型Ⅰ的國際標(biāo)準(zhǔn)株H87株及中國80-2株核苷酸差異大于5%,氨基酸差異為3%。

2.2 DENV-3義烏分離株 E蛋白的分泌表達(dá)J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,利用IFA檢測胞內(nèi)表達(dá)情況,結(jié)果如圖2所示,分別以DENV-3 EⅢ蛋白兔免疫血清及登革病人血清為一抗,胞內(nèi)均可檢測到熒光顆粒,同時轉(zhuǎn)染pcDNA5/FRT載體的細(xì)胞中未見熒光,說明DENV-3 E蛋白在293T細(xì)胞內(nèi)得到特異表達(dá)。利用Western blot檢測E蛋白在上清中的分泌情況,結(jié)果如圖3所示,分別以DENV-3 EⅢ蛋白兔免疫血清及登革病人血清為一抗,J ESS-ywD3prM/E397 J EV-pcDNA5轉(zhuǎn)染上清在60kD處均可見明顯E蛋白目的條帶,同時轉(zhuǎn)染pcDNA5/FRT載體的上清中未見目的蛋白的分泌表達(dá)。

圖1 登革3型病毒系統(tǒng)發(fā)生樹A:E基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹;B:E蛋白氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹;C:NS1基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹;D:NS1蛋白氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.1 DENV-3 phylogenetic treesA:Phylogenetic tree based on E nucleotide sequences;B:Phylogenetic tree based on E amino acid sequences;C:Phylogenetic tree based on NS1 nucleotide sequences;D:Phylogenetic tree based on NS1 amino acid sequences

圖2 IFA檢測重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞中的表達(dá)A,C:J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞;B,D:pcDNA5/FRT載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞;A,B:DENV-3 EⅢ蛋白兔免疫血清為抗體檢測;C,D:登革病人血清為抗體檢測Fig.2 Immunofluorescence assay of E protein expression in 293T cellA,C:293T cells transfected with J ESS-ywD3prM/E-pcDNA5;B,D:293T cells transfected with pcDNA5/FRT;A,B:E protein detected by DENV-3 EⅢrabbit immune serum;C,D:E protein detected by dengue patient serum

圖3 Western Blot檢測 E蛋白分泌表達(dá)M:蛋白預(yù)染Marker;A:陰性對照;B:DENV-3 EⅢ蛋白兔免疫血清為抗體檢測J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5轉(zhuǎn)染上清;C:登革病人血清血清為抗體檢測J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5轉(zhuǎn)染上清Fig.3 Western blot analysis of extracellular E proteinM:PageRuler Prestained Protein Ladder;A:Negative control;B:J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5 transfection supernatants detected by DENV-3 EⅢrabbit immune serum;C:J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5 transfection supernatants detected by dengue patient serum

2.3 DENV-3義烏分離株分泌性E蛋白的免疫原性測定 純化的DENV-3義烏分離株分泌性 E蛋白免疫小鼠后運用 ELISA方法檢測抗四個型別登革病毒 EIII蛋白的 IgG抗體滴度,結(jié)果如圖4所示。分泌性E蛋白刺激小鼠產(chǎn)生的抗體可以分別與四個型別登革病毒的 EIII蛋白反應(yīng),其中針對DENV-3 EIII蛋白抗體滴度可達(dá)1∶1 400,與抗其他三個型別EIII蛋白的抗體水平有顯著性差異(P<0.05)。其余各組間均無統(tǒng)計學(xué)差異。微量細(xì)胞病變中和試驗檢結(jié)果如表1所示,DENV-3義烏分離株分泌性E蛋白能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定水平的抗登革3型病毒的中和抗體,中和滴度明顯高于PBS對照組(P<0.05),但DENV-3義烏分離株分泌性E蛋白誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗體并不能有效的中和其他3個型別的登革病毒。

3 討 論

圖4 ELISA檢測小鼠血清IgG抗體滴度＊表示該組與其他各組均存在統(tǒng)計學(xué)差異Fig.4 Mouse serum IgGantibody titer identified by ELISA＊Indicates significant differences with other groups

表1 免疫小鼠血清中和抗體檢測Table1 Neutralizing antibody titers of immunized mice

本研究利用分子流行病學(xué)方法,對2009年9月浙江省義烏市暴發(fā)流行的登革毒株進行系統(tǒng)進化分析,結(jié)果顯示該株病毒屬于登革3型病毒亞型Ⅲ[4],且與廣州2009年流行株同源性最高,提示浙江省義烏市所流行的登革3型病毒可能與廣州 GZ1D3來自于同一進化源頭,此源頭可能為2003年印度流行的GWL-25株?？紤]此次義烏登革病毒流行的毒株可能來源于印度,從而引起2009年廣州和浙江義烏的登革3型病毒的流行。真正的輸入性流行情況有待進一步的流行病學(xué)資料加以證實。

E蛋白是黃病毒屬病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白,能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。E蛋白的表達(dá)研究有利于病毒診斷及疫苗研究的發(fā)展。中和抗體是抵抗登革病毒感染的關(guān)鍵,自然狀態(tài)下感染登革病毒會產(chǎn)生較高滴度的抗同型病毒的中和抗體,同時產(chǎn)生具有與其他三個血清型存在交叉反應(yīng)的但無中和活性的抗體[5]。本研究通過對登革3型病毒義烏分離株prM/E基因進行改造,在哺乳動物細(xì)胞中獲得了分泌表達(dá)的 E蛋白,可與登革病人血清發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。將 E蛋白免疫BALB/c小鼠并測定其誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng),結(jié)果顯示登革3型病毒分泌性 E蛋白可刺激小鼠產(chǎn)生針對DENV1-4 EIII蛋白的IgG抗體,但僅與登革3型病毒具有中和活性。該研究結(jié)果為登革診斷抗原的制備及登革疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

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