翁育偉，周朝暉，陳 煒，鄭奎城，嚴(yán)延生

2010年福建省手足口病患者中柯薩奇B5病毒的序列分析＊

翁育偉1，2，周朝暉2，陳 煒2，鄭奎城2，嚴(yán)延生2

目的了解福建省手足口病患者中CVB5（Coxsackie virus B5）病毒的變異及進(jìn)化特征。方法采集2010年福建省手足口病例呼吸道標(biāo)本，經(jīng)RD細(xì)胞分離腸道病毒。病毒分離上清用于RNA提取并經(jīng)RT－PCR法鑒定病毒型別。對(duì)鑒定為其他腸道病毒（非EV71或CVA16）的病毒，擴(kuò)增病毒完整VP1區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆、篩選后測(cè)序。應(yīng)用Mega軟件對(duì)病毒VP1序列進(jìn)行比較和種系進(jìn)化分析。結(jié)果從2010年福建省手足口病患者中擴(kuò)增得到6株完整的VP1區(qū)序列，序列比對(duì)證實(shí)有4株CVB5病毒，其他2株為Echo9病毒。序列差異比較表明，分離自福建省的CVB5病毒一致性程度較高，在種系進(jìn)化上處于獨(dú)立的進(jìn)化分支，而與國(guó)內(nèi)其他省份或其他國(guó)家的CVB5病毒分離株比較則有較大差異。結(jié)論2010年福建省手足口病患者中存在CVB5病毒的感染，病毒與既往其它省份分離株有較大差異，提示CVB5病毒在福建省具有獨(dú)特的傳播鏈。

手足口?。豢滤_奇B5；種系分析

手 足 口 病 （Hand－Foot－Mouth Disease，HFMD）是由多種人腸道病毒（Human enterovirus，HEV）引起的一種急性傳染病，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀，少數(shù)患者可出現(xiàn)無(wú)菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、神經(jīng)源性肺水腫和心肌炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，個(gè)別重癥病例可導(dǎo)致死亡。腸道病毒型別復(fù)雜，所致臨床癥狀多樣。除腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯薩奇病毒A16型（Coxsackie virus A 16，CVA16）為HFMD的主要病原體外，其他腸道病毒血清型，如柯薩奇 A 組病毒中的CVA2、4、5、6、9、10型，柯薩奇B組病毒的1－5型以及?？刹《荆‥chovirus，E）中的E6、E9、E13、E25、E30等也可導(dǎo)致 HFMD或者無(wú)菌性腦炎、腦炎、麻痹等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀［1－3］。2010年，福建省在HFMD的病原學(xué)監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)了4例CVB5病毒感染病例，為了解這些病例中CVB5病毒的特征，我們對(duì)上述CVB5病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1進(jìn)行了序列測(cè)定和分析。

1 材料與方法

1．1 材料 HFMD病毒呼吸道標(biāo)本來(lái)自于HFMD監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院。用于病毒分離的RD細(xì)胞為本單位保存。病毒RNA提取試劑、一步法RTPCR試劑盒以及PCR產(chǎn)物純化試劑均為Qiagen公司產(chǎn)品。TA克隆試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞等購(gòu)自Ta KaRa公司。引物（見(jiàn)表1）合成及序列測(cè)定由Ta KaRa公司完成。

1．2 方法

1．2．1 病毒分離 感染者呼吸道標(biāo)本的采集和處理按中國(guó)疾病預(yù)防控制中心下發(fā)《手足口病監(jiān)測(cè)方案（2010年版）》。人橫紋肌肉瘤（rhabdomyosarcoma，RD）細(xì)胞用含10%胎牛血清的細(xì)胞生長(zhǎng)液（MEM）傳代，長(zhǎng)滿單層后經(jīng)胰酶消化，接種于斜面細(xì)胞培養(yǎng)管，置36℃、5%CO2培養(yǎng)，長(zhǎng)至成80%～90%單層后，吸棄細(xì)胞生長(zhǎng)液，更換成含2%胎牛血清的細(xì)胞維持液2 m L，接入處理好的標(biāo)本200μL，繼續(xù)培養(yǎng)至第7 d，每天觀察細(xì)胞病變情況。如7 d內(nèi)產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變，則收集上清凍于－70℃，無(wú)細(xì)胞病變的取上清再盲傳一代。

表1 病毒鑒定引物及VP1區(qū)擴(kuò)增使用的引物一覽表Tab．1 Primers used for viral identification and amplification of VP1 gene

1．2．2 病毒RNA提取和RT－PCR鑒定 收集病毒分離物，凍融3次后，10 000 r／min離心5 min。取上清140按Qiagen RNA mini kit說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA。病毒RNA洗脫于50洗脫液，－70℃保存?zhèn)溆?。采用Qiagen One－step RT－PCR反應(yīng)盒試劑盒做病毒型別鑒定。配置RT－PCR反應(yīng)體系：5×buffer 5μL，d NTP（10mmol／L）1μL，上下游引物（10μmol／L）各1μL，酶混合物1μL，DEPC－treated H2O補(bǔ)足到20μL，加入5μL病毒RNA至總體積為25μL。按下列反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：42℃反轉(zhuǎn)錄45 min；95℃滅活10 min；95℃，30 s；50 ℃，30 s；72℃，30 s；共35循環(huán)擴(kuò)增，72℃，10 min后4℃保溫。分別使用引物 EV71－F／EV71－R，CVA16－F／CVA16－R和PE1／PE2做EV71、CVA16以及其他腸道病毒的鑒定。RT－PCR產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳后觀察。

1．2．3 病毒VP1區(qū)的擴(kuò)增、片斷克隆及序列測(cè)定將上述鑒定為非EV71和非CVA16的其他腸道病毒培養(yǎng)物按上述方法提取RNA后，應(yīng)用008／009引物擴(kuò)增病毒的VP1區(qū)。除使用引物不同外，RTPCR反應(yīng)體系同上。按下列反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min；95℃滅活15 min；95℃，40 s；50℃，40 s；72 ℃，1 min；共35循環(huán)擴(kuò)增，72 ℃，10 min后4℃保溫。產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳后，按QIA Gel extraction試劑盒說(shuō)明，回收純化目的條帶，置－20℃?zhèn)溆谩＜兓蟮臄U(kuò)增產(chǎn)物按試劑盒說(shuō)明克隆至p MD－18T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感染態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆后交Ta KaRa公司測(cè)序。

1．2．4 CVB5病毒VP1區(qū)基因序列分析 應(yīng)用DNAStar軟件對(duì)病毒序列進(jìn)行拼接，經(jīng)Blast程序在GenBank中作序列比對(duì)確定病毒血清型。從GenBank下載CVB5病毒完整VP1序列，應(yīng)用Clustal w對(duì)下載的序列和本研究獲得VP1序列作多重排列，應(yīng)用 Mega（version 3．1）軟件，比較不同病毒株VP1序列的差異，并做種系進(jìn)化分析（Neighbor－Joining法）。

2 結(jié) 果

2．1 病毒分離與鑒定 應(yīng)用RD細(xì)胞分離和RTPCR法，從2010年福建省手足口病監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院送檢的標(biāo)本中分離其他腸道病毒（非EV71或CVA16）共14株。

2．2 病毒VP1區(qū)的擴(kuò)增 應(yīng)用008／009引物對(duì)擴(kuò)增其中6株病毒的VP1基因片段，回收產(chǎn)物經(jīng)TA克隆到p MD18T載體后測(cè)序。VP1序列測(cè)定和blast比對(duì)表明，其中4株病毒為CVB5，另外2株為Echo9。4例CVB5病毒感染病例情況見(jiàn)表2。

表2 4例CVB5感染手足口病病例信息Tab．2 Information of 4 patients infected with CVB5 in Fujian Province

2．3 病毒VP1序列分析 不同地區(qū)和時(shí)間病毒分離株的VP1區(qū)序列比較表明，2010年福建省分離的4株CVB5病毒的核苷酸差異為1．17%（0．12%～2．16%），氨基酸的差異為0．55%（0～1．07%）。與浙江、山東以及韓國(guó)等地不同時(shí)間分離的CVB5病毒比較，福建省CVB5病毒與上述分離株的VP1區(qū)核酸的差異為4．93%～6．52%，而氨基酸的差異為0．64%～1．74%，見(jiàn)表3。與上述病毒VP1區(qū)氨基酸序列相比，福建分離株在VP1蛋白95位氨基酸為N，而其他參與比較的分離株在該位置則為S。2．4 種系進(jìn)化分析 以VP1區(qū)序列做種系進(jìn)化分析，全球不同地區(qū)和年度CVB5病毒至少可以分為2群（Linage，L），其bootstrap值分別為95和99。其中L1群病毒在亞洲和歐洲國(guó)家具有分布，而L2群病毒僅在歐洲國(guó)家（法國(guó)、白俄羅斯、英國(guó)等）流行。福建省CVB5病毒屬于L1群，但與國(guó)內(nèi)山東、浙江以及韓國(guó)等地的病毒處于不同的分支上（Bootstrap值前者為99，后者為98），見(jiàn)圖1。

3 討 論

CVB5病毒屬于腸道病毒B組成員（Human enterovirus B species），在遺傳上與豬水泡病毒（Swine Vesicular disease virus，SVDV）相 似［10］。CVB5病毒感染可導(dǎo)致無(wú)菌性腦膜炎［4－5，11］等多種疾病，是常見(jiàn)的人感染腸道病毒血清型。1970－2005年美國(guó)腸道病毒監(jiān)測(cè)表明，CVB5是人腸道病毒感染最常見(jiàn)的的血清型之一［3］。CVB5在法國(guó)、德國(guó)等歐洲國(guó)家的流行也較常見(jiàn)［7－8］。在亞洲，Baek等對(duì)2005－2006年韓國(guó)忠清南道無(wú)菌性腦膜炎病例的流行病學(xué)和病毒特征研究表明2005年病例有25%以上為CVB5感染［6］。國(guó)內(nèi)在上世紀(jì)90年代就發(fā)現(xiàn)中樞系統(tǒng)感染者中存在CVB5腸道病毒感染的現(xiàn)象［12］。浙江省在2008年病毒性腦膜腦炎病例中，分離到5株CVB5病毒［11］。2009年山東HFMD流行期間，有近1／5腸道病毒為 CVB5［13］。福建省2010年HFMD監(jiān)測(cè)中，從包括1例重癥病例在內(nèi)的HFMD病例中分離到4株CVB5病毒。這些現(xiàn)象提示，在我國(guó)，CVB5可能成為除EV71、CVA16以外導(dǎo)致HFMD的又一重要腸道病毒血清型。

表3 CVB5病毒分離株VP1區(qū)序列差異分析Tab．3 Diversity of nucleotide and amino acid sequence in VP1 region of CVB5 isolates

圖1 CVB5腸道病毒分離株VP1區(qū)序列種系進(jìn)化分析Fig．1 Phylogenetic analysis of VP1 region of CVB5 isolates

腸道病毒VP1編碼區(qū)在病毒分類(lèi)和進(jìn)化關(guān)系研究中具有重要意義［9］。我們對(duì)全球流行的CVB5病毒的VP1區(qū)的進(jìn)化分析表明，不同國(guó)家和時(shí)期的CVB5病毒大致可以分為2個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化群（Linage，L），其中L1群包括了CVB5原型株、上世紀(jì)90年代和2005年左右歐洲流行的毒株以及流行于韓國(guó)、中國(guó)等亞洲國(guó)家的CVB5病毒，而2003－2006年期間在法國(guó)、白俄羅斯等歐洲國(guó)家流行的毒株構(gòu)成了L2群。值得注意的是，2010年福建省分離的CVB5病毒屬于L1群，但與該群的其他毒株比較，4株病毒構(gòu)成了一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化分支。VP1區(qū)核酸序列差異分析表明，山東、浙江以及韓國(guó)分離的毒株序列差異為0．18%～3．34%，而福建省CVB5分離株與上述毒株的差異為4．93%～6．52%，因此推斷福建省CVB5的流行可能存在著不同于國(guó)內(nèi)其他省份的傳染源，但從病毒氨基酸序列比較表明，福建省CVB5病毒與其他省份和韓國(guó)等地的病毒差異不大，為0．64%～1．74%，較為明顯的差異存在于VP1氨基酸序列的95位，福建省分離株在95位上為N，而其他省份以及韓國(guó)分離株則為S。上述結(jié)果提示，福建省CVB5病毒和其他省份以及韓國(guó)的CVB5分離株的抗原特征相似。

了解HFMD病例的病原譜和流行病學(xué)特征是HFMD防控工作的重要環(huán)節(jié)。目前，HFMD的病原體主要為腸道病毒EV71和CVA16，對(duì)其遺傳進(jìn)化特征的研究較多，而對(duì)HFMD病例中的其他腸道病毒的遺傳進(jìn)化特征則較少研究。由于其他腸道病毒在HFMD的病原譜中也占有相當(dāng)?shù)谋壤?，因此做好HFMD防治工作，必須了解這些病毒的遺傳進(jìn)化、抗原變異等特征?；诖?，本研究對(duì)福建省分離的CVB5病毒的主要抗原基因進(jìn)行了遺傳進(jìn)化特征分析，為今后福建省HFMD的防治提供了基礎(chǔ)資料。

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Phylogenetic analysis on Coxsackie virus B5 isolated from Fujian Province，2010

WENG Yu－wei，ZHOU Chao－h(huán)ui，CHEN Wei，ZHENG Kui－cheng，YAN Yan－sheng

（Fujian Center for Disease Control and Prevention，F(xiàn)uzhou 350001，China）

The aim was to explore the variance and phylogenetic features of Coxsackie virus B5（CVB5）isolated from hand－foot－mouth disease（HFMD）patients in 2010 in Fujian，China．The respiratory specimen from HFMD patients were collected and cultured on RD cells for viral recovery．Viral RNA was extracted form the supernatant of culture and used for viral typing by reverse－transcript PCR．The whole VP1 region of the CVB5 isolates was obtained by RT－PCR，and followed by cloning into plasmid and sequencing．The variance and phylogenetic relation between CVB5 isolates from Fujian and that from other provinces and counties were calculated by using Mega software．It was found that of 6 viral isolates from Fujian Province in 2010，four were identified as CVB5 and the others were Echo9．The sequence analysis indicated that the CVB5 isolates from Fujian shared higher identity and formed a distinct branch on the phylogenetic tree，whereas showed more difference when compared with isolates from other province in China and from other countries．These results demonstrated that CVB5 virus had emerged in HFMD patients in Fujian and the transmission chain of CVB5 virus in Fujian might be distinct from that from other provinces．

hand－foot－mouth disease；Coxsackie virus B5；phylogenetic analysis

R373．2＋3

A

1002－2694（2011）12－1086－04

＊福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No．2010J01115）資助

嚴(yán)延生，Email：yysh＠pub1．fz．fj．cn

1．福建醫(yī)科大學(xué)，福州 350001；2．福建省疾病預(yù)防控制中心，福州 350001

2011－05－10；

2011－08－29