陳菁瑛，劉 萍，黃穎楨，蘇海蘭

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究中心，福建福州350003)

仙草(Mesona chinensis Benth.)又名涼粉草，是唇形科仙草屬一年生草本植物，分布于我國(guó)的廣東、福建、廣西、江西、海南、浙江、臺(tái)灣和云南等地，印度、印度尼西亞、馬來(lái)西亞也有分布，我國(guó)南方幾個(gè)省區(qū)部分地方有田間栽培習(xí)慣。據(jù)《中藥大辭典》［1］記載，仙草性味澀、甘、寒，具有清暑解渴、涼血之功效。古代醫(yī)藥書(shū)《本草求原》記載，仙草有“清暑熱，解藏府結(jié)熱毒，治酒風(fēng)”的功效，在《嶺南采藥錄》中記載，仙草可治花柳毒入骨。中醫(yī)認(rèn)為仙草性涼寒、味甘淡澀，具有清熱利濕、涼血解暑、解渴利水和除熱毒之功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分析測(cè)定認(rèn)為，仙草中的熊果酸和齊墩果酸有降溫、鎮(zhèn)靜、降血糖的作用［2－3］。仙草作為中草藥、制作涼粉凍及涼茶在我國(guó)已有悠久的歷史［4］，隨著涼茶申遺成功、涼茶功能認(rèn)知度的提高以及人們保健意識(shí)的增強(qiáng)，涼茶市場(chǎng)份額猛增，王老吉、和其正、龜苓膏、清涼爽等產(chǎn)品陸續(xù)登陸市場(chǎng)，廠(chǎng)家爭(zhēng)奪仙草原料劇烈;仙草又是南方一些地方傳統(tǒng)出口創(chuàng)匯的農(nóng)產(chǎn)品;隨著國(guó)內(nèi)國(guó)際市場(chǎng)的需求量日益增大，生產(chǎn)供不應(yīng)求，野生資源逐漸減少，擴(kuò)大人工栽培已成為仙草原料的主要來(lái)源，福建龍巖、建甌和廣東增城、梅縣等地均有大面積的仙草種植基地。調(diào)查發(fā)現(xiàn)不同種源的仙草在株型、葉片形態(tài)和披覆茸毛多少及化學(xué)成分含量等方面均存在較大差異，有關(guān)不同仙草種源間的遺傳背景和親緣關(guān)系的研究更未見(jiàn)報(bào)道。為了更好地選擇和利用仙草資源滿(mǎn)足生產(chǎn)需要，本研究采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)20份不同種源的仙草進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系的分析，以期探討仙草種源間的親緣關(guān)系，為仙草的引種栽培、資源保護(hù)和選種育種提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試20份仙草種源分別為收集采自我國(guó)福建、廣東、臺(tái)灣和廣西等省區(qū)及印度尼西亞的17個(gè)栽培種源、2個(gè)野生種源以及印尼與廣東朝陽(yáng)雜交F1代種源，栽種于福建省農(nóng)科院藥用植物中心的藥用植物資源保存基地。供試仙草種源的來(lái)源地及主要形態(tài)特征如表1所示。

表1 供試仙草種源及主要形態(tài)特征

1.2 方法

1.2.1 仙草基因組DNA的提取

用改良的CTAB法提取仙草葉片基因組DNA。取仙草幼嫩葉片0.3 g左右，加液氮快速充分研磨至粉末狀;將粉末移至2.0 mL離心管中，加入800 μL預(yù)熱至65℃的2×CTAB提取緩沖液［100 mmol/L Tris－HCl(pH 8.0)、20 mmol/L EDTA(pH8.0)、1.4 mmol/LNaCl、2%CTAB、2%PVP、2% 巰基乙醇］，充分混勻;65℃水浴10 min，期間顛倒數(shù)次;加等體積的混合液［氯仿:異戊醇 =24∶1(V∶V)］，于室溫下12 000 r/min離心10 min;取上清液至另一離心管，加等體積異丙醇，室溫放置5 min，于室溫下12 000 r/min離心10 min;用70%(體積濃度)乙醇洗滌DNA 2～3次，風(fēng)干;將DNA溶于500 μLTE溶液［10 mmol/L Tris－HC1(pH8.0)，1 mmol/L EDTA(pH8.0)］，加入1 μL RNase(10 g/L)并于 37℃溫育30 min;加等體積氯仿異戊醇抽提，上清液加入1/10體積3mol/L NaAc，2倍體積冰冷無(wú)水乙醇混勻，－20℃放置 10min，12 000 r/min 離心 10min，沉淀用70%乙醇洗滌后加適量TE溶解，－2O℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 仙草基因組DNA純度與濃度的檢測(cè)

取1 μL DNA 溶液稀釋到 50 μL，用 Ependorf Biophotometer檢測(cè) DNA的濃度和純度。取少量DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析DNA質(zhì)量。

1.2.3 ISSR引物退火溫度的確定及PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)總體積為20 μL，其中含模板DNA50 ng，0.5 μmol/L 引物，0.2 mmol/LdNTP，1.5 mmol/LMgCl2，1 UTaqDNA 聚合酶，2 μL 10 ×PCR 緩沖液，加入滅菌的超純水至20 μL。擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性 3 min;94℃變性1 min，42 ～53℃退火1 min，72℃延伸2 min，共40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為T(mén)AE，電壓為80 V，電泳1.5 h，EB染料染色10 min，用凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

ISSR分子標(biāo)記為顯性標(biāo)記，同一引物的擴(kuò)增條帶按同一遷移位置的有帶(包括弱帶)記為“1”，無(wú)帶記為“0”的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用NTSYS—PC軟件按照UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建不同種源間的遺傳關(guān)系樹(shù)狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 仙草基因組DAN純度與濃度檢測(cè)

采用CTAB法提取的DNA色澤為白色或無(wú)色，說(shuō)明大多數(shù)酚類(lèi)、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)已被去除。提取得到的仙草基因組DNA經(jīng)紫外檢測(cè)測(cè)得OD260/OD280比值均在1.7～1.9之間，說(shuō)明得到的仙草基因組DNA較純。同時(shí)，提取的仙草基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，各條帶整齊、清晰、明亮、基本無(wú)降解、完整性好，顯示其條帶都在15kb以上(如圖1所示)，說(shuō)明所提取的DNA質(zhì)量較高，完全能達(dá)到ISSR分析的要求。

圖1 20份仙草基因組DNA的電泳圖譜

2.2 ISSR引物適宜退火溫度的確定

退火溫度是影響ISSR－PCR的重要因素之一，因此適宜退火溫度的確定對(duì)獲得穩(wěn)定可靠的結(jié)果具有至關(guān)重要的作用。而引物的退火溫度不僅與引物本身的序列有關(guān)，還會(huì)隨物種的不同而改變，因此在進(jìn)行PCR擴(kuò)增前必須確定每條引物最適宜的退火溫度。

以引物Tm值獲得的退火溫度為依據(jù)進(jìn)行溫度梯度PCR，經(jīng)電泳之后統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增條帶數(shù)和條帶亮度。圖為引物850退火溫度梯度PCR結(jié)果，從圖2可以看出，第1和第2泳道的條帶清晰且亮，其適宜溫度在45～47℃之間，而較高的退火溫度可以較少非特異性條帶，因此確定47℃為引物850的最適宜退火溫度。以同樣的方法確定其它引物最適宜的退火溫度，結(jié)果如表2所示。

圖2 引物850退火溫度梯度PCR的電泳圖譜

2.3 ISSR－PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

從40條ISSR引物中篩選得到18條多態(tài)性好、條帶清晰且穩(wěn)定的引物，對(duì)18條引物進(jìn)行退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)，最終確定每條引物最適宜的退火溫度，最后對(duì)20份仙草品種進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如表2所示。ISSR－PCR擴(kuò)增的片段集中在200～2000 bp，每條多態(tài)性引物可擴(kuò)增出2～10條帶，18條引物共擴(kuò)增出114條帶，其中53條為多態(tài)帶，多態(tài)性比率為 46.5%。

表2 ISSR引物及擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性水平

圖3 引物810擴(kuò)增20份仙草DNA的電泳圖譜

2.4 遺傳相似性分析

利用NTSYS－pc軟件計(jì)算了20份仙草種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)，種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)介于0.37～0.96之間。其中5號(hào)漳州云霄仙草與7號(hào)印尼仙草的相似系數(shù)最小，為0.37，表明這兩份種源間的遺傳距離最遠(yuǎn)。17號(hào)廣東梅州與18號(hào)三明永安的相似系數(shù)最大，表明這兩者之間可能存在一定的親緣關(guān)系。

2.5 仙草種質(zhì)親緣關(guān)系的聚類(lèi)分析

利用NTSYS－pc軟件的UPGMA方法對(duì)20份仙草進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖。從樹(shù)狀圖中可以看出，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.73時(shí)，可將供試的20份仙草分為3大類(lèi)組，其中4號(hào)與7號(hào)聚為一類(lèi)，7號(hào)仙草來(lái)自印尼，4號(hào)仙草是印尼與廣東朝陽(yáng)雜交F1代，這與其來(lái)源相符合。14號(hào)與20號(hào)聚為一類(lèi)，這兩個(gè)分別來(lái)自浦城和武平野生的種源自然聚成一類(lèi)，進(jìn)一步驗(yàn)證了ISSR分子標(biāo)記的可靠性。

圖4 供試品種的親緣關(guān)系樹(shù)狀圖

3 討論

在ISSR分子標(biāo)記中，模板DNA的質(zhì)量是決定PCR成功與否的關(guān)鍵。只有高質(zhì)量的DNA才能擴(kuò)增出清晰的條帶。由于仙草葉片當(dāng)中富含多酚類(lèi)及多糖類(lèi)物質(zhì)［5］，在DNA提取過(guò)程中與DNA共沉淀，形成膠狀物難以溶解或產(chǎn)生褐變，嚴(yán)重影響了DNA的質(zhì)量［6］，從而嚴(yán)重影響提取的DNA質(zhì)量。本研究以新鮮幼嫩的仙草葉片為材料，利用改良的CTAB法提取基因組DNA。CTAB法對(duì)提取步驟要求較為嚴(yán)格，提取DNA時(shí)，65℃水浴時(shí)間需嚴(yán)格控制，過(guò)短(小于10min)DNA得率下降，過(guò)長(zhǎng)則會(huì)引起DNA降解或者增加更多的雜質(zhì)。為了提高仙草總DNA純度，水浴時(shí)間必須嚴(yán)格控制在10～15 min。這與文獻(xiàn)報(bào)道的提取方法［7］不完全一致。另外為了徹底去除雜質(zhì)、提高DNA純度，提取過(guò)程中可適當(dāng)增加抽提次數(shù)，提取時(shí)需避免劇烈震蕩，以防止DNA機(jī)械損傷。最后需對(duì)提取的DNA進(jìn)行純化。

ISSR(Inter Simple Sequence Repeat，簡(jiǎn)單重復(fù)間隔序列)標(biāo)記是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)，不但具有RAPD標(biāo)記的簡(jiǎn)便易行、快速方便等特點(diǎn)，還具有穩(wěn)定性好、多態(tài)性高，所揭示遺傳多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，目前在藥用植物的遺傳多樣性、物種鑒別研究中已有一些研究報(bào)道［8－10］。本文通過(guò)引物篩選實(shí)驗(yàn)，從40條ISSR引物中篩選得到18條多態(tài)性好、條帶清晰且穩(wěn)定的引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增，純化處理得到高質(zhì)量的完全符合PCR擴(kuò)增的模板DNA，使該方法能夠直接應(yīng)用到仙草種源遺傳關(guān)系的分析研究中。在實(shí)驗(yàn)研究中，不同種源的仙草選取了多個(gè)樣本進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，在穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)體系下，能夠得到具有一定穩(wěn)定性的DNA指紋圖譜，表明該方法分析仙草種源遺傳關(guān)系具有很好的重復(fù)性。

UPGM聚類(lèi)分析結(jié)果表明，除來(lái)自印尼的7號(hào)及其與廣東朝陽(yáng)的雜交后代4號(hào)、同為野生的14號(hào)和20號(hào)外，其他種源間遺傳差異較小，說(shuō)明國(guó)外與國(guó)內(nèi)的仙草種源間、野生與栽培種源間的均有較遠(yuǎn)的遺傳距離，遺傳背景差異較大。而國(guó)內(nèi)栽培的仙草種源都聚為同一類(lèi)，可見(jiàn)仙草不同種源間的遺傳差異與地理分布聯(lián)系不緊密，這與麥冬、丹參的研究結(jié)果相似［9，11－12］。表明地理距離在仙草的遺傳分化中可能并非是主導(dǎo)因素，其遺傳分化的因素還需要結(jié)合生殖生物學(xué)與生態(tài)學(xué)方面的研究給出科學(xué)的評(píng)價(jià)。

我們收集種源時(shí)發(fā)現(xiàn)，福建、廣東和廣西等省區(qū)群眾均有使用和種植仙草的傳統(tǒng)習(xí)慣，福建和廣東、廣東和廣西之間各地民間種苗交流頻繁，且至今未見(jiàn)歷史上仙草栽培中有人工選擇的報(bào)道，因此，來(lái)自福建、廣東和廣西的仙草栽培種源聚為一類(lèi)可能與各地間互相引種、未見(jiàn)人工選擇有關(guān)。說(shuō)明了仙草栽培種源的遺傳背景較為單一，在今后的研究中，應(yīng)關(guān)注野生類(lèi)型的收集及地域跨度，豐富仙草的種質(zhì)資源，為仙草遺傳育種奠定基礎(chǔ)。

［1］江蘇省醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典:下冊(cè)［M］.上海:上海人民出版社，1977:1915－1916.

［2］柳占彪，王 鼎.齊墩果酸的降糖作用［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，1994，29(12):725－726.

［3］于海濤，張巍于，英 君.熊果酸藥理機(jī)制的研究［J］.中國(guó)健康月刊，2010，29(4):26－28.

［4］諶國(guó)蓮，孫遠(yuǎn)明，黃曉鈺，等.中國(guó)涼粉草資源的研究與利用［J］.農(nóng)牧產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，2000(5):6－8.

［5］劉素蓮.涼粉草化學(xué)成分的初步研究［J］.中藥材，1995，18(5):247－248.

［6］Wang D H，Song K M，Carol K，e t al.A High－Throughput System for the Rapid Extraction of Plant Genomie DNA for Genome Mapping and Marker－Assisted Breeding Studies［J］.Journal of the Association for Laboratory Automation，2005，10(4):242—245.

［7］關(guān)杰敏，張桂芳，林 吉，等.涼粉草基因組DNA提取與分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(20):10575－10577.

［8］王 艷，李先恩，李學(xué)東，等.野生地黃種內(nèi)遺傳多樣性的RAPD、ISSR分析［J］.中國(guó)中藥雜志，2008，33(22):2591－2595.

［9］徐 紅，王燕燕，魏丹紅，等.不同產(chǎn)地丹參藥材的ISSR分析與鑒別［J］.中藥新藥與臨床藥理，2007，18(6):454－457.

［10］趙 楠，李宏慶.地黃居群遺傳多樣性的ISSR分析［J］.河南科學(xué)，2009，27(11):1386－1391.

［11］黃玉吉，陳菁瑛，蘇海蘭，等.麥冬遺傳多樣性的RAPD分析及分子指紋圖譜構(gòu)建［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25(23):58－63.

［12］徐 柯，鄭 嗚，曹 毅，等.四川麥冬自然居群間RAPD分析［J］.中草藥，2002，33(7):648－652.