張?zhí)苽?柳青海,李天才

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所,青海西寧 810008;2.中國科學(xué)院研究生院,北京 100049)

地木耳 (Nostoc comm uneVauch)俗稱地皮菜、地耳、鼻涕肉、地踏菜、地軟、地衣、地?fù)炱さ?為藻類藍(lán)藻綱念珠藻科 (Nostocaceae)念珠藻屬植物念珠藻(Nostoc comm uneVauch)的藻體。它與發(fā)菜 (N.flagellifor m e)、葛仙米 (Nostoc sphaeroidesKutzing)為同屬植物[1]。自然生長的地木耳為草綠色,粘球狀,植物體常集合形成肉眼可以看見有膠狀球形或不規(guī)則的擴(kuò)展群。地木耳不耐干旱,在干旱脫水后,藻體呈葉狀薄片,易碎裂,潮濕吸水后又呈不規(guī)則形的隆起,裂葉狀擴(kuò)展,深綠色。地木耳的藻絲在膠鞘內(nèi)無規(guī)則地排列,在藻體的繁殖發(fā)育期有異形胞存在[2]。地木耳是世界廣生種,主要分布在石灰石區(qū)和喀斯特巖溶地帶。在我國幾乎都有分布,資源豐富,并且生命力極強(qiáng),即使休眠幾十年,一遇水又馬上恢復(fù)生機(jī)。地木耳一般在夏秋季雨后采收,去雜質(zhì)洗凈,鮮用或曬干[3]。據(jù)研究地木耳含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、維生素、鈣、磷、鐵等 ,《本草綱目 》記載:地木耳氣味甘、平、無毒,主治明目益氣,補(bǔ)腎?！吨袊幍洹酚涊d:野生地木耳對補(bǔ)充維生素、蛋白質(zhì)、清熱解毒、涼血明目、夜盲、皮疹赤熱等有明顯滋補(bǔ)食療效果。目前對地木耳多糖的研究較少,本實驗對地木耳多糖的提取、分離、純化及純度鑒定進(jìn)行了研究,旨在為地木耳的進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地木耳于 2009年采自青海省西寧市西山。采回后自來水洗凈泥沙,然后用蒸餾水清洗,自然晾干 ,粉碎。

DEAE-52 What man公司;透析袋 (截留量為3000)Whatman公司;無水乙醇、丙酮、石油醚、氯仿、正丁醇、濃硫酸、苯酚、甲苯胺藍(lán)、瓊脂糖及巴比妥鈉等。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-12型電腦三恒多用電泳儀 (水平電泳槽),北京六一儀器廠;721可見光分光光度計,上海儀器廠;電子天平,美國派布洛克公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;循環(huán)水式多用真空泵 SHB-III,陜西太康生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 地木耳多糖的提取

稱取 100 g干燥的粉碎過篩的地木耳粉末,用800 mL 80%乙醇浸泡 24 h去脂[4],用雙層紗布過濾。濾渣風(fēng)干后用 60倍蒸餾水 90℃水浴浸提 5次,每次 3 h,合并提取液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,用 Sevage法[5]多次脫蛋白至蛋白質(zhì)除盡為止,透析,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,加入 95%乙醇使醇濃度達(dá)到 70%,于 4℃冰箱中醇沉過夜,離心,沉淀物依次用無水乙醇,丙酮和石油醚洗滌,在烘箱中 60℃干燥得白色的地木耳精制多糖,備用。

1.3.2 地木耳多糖的分離與純化

將地木耳精制多糖用蒸餾水配成 3 mg/mL的溶液,5 000 r/min離心 10 min后,取 150 mL進(jìn)行DEAE-52纖維素陰離子交換色譜層析,用蒸餾水、0.1～0.5 mol/L的 NaCl以 1 mL/min的流速洗脫,每 10 min收集一管,用苯酚 -硫酸法[6]在 490 nm波長處逐管檢測。

1.3.3 純化多糖的純度鑒定

1.3.3.1 紙層析法[7]新華 2號濾紙,點樣量為0.5%純化多糖水溶液 20μL;展層劑為正丁醇∶濃氨水 ∶水 (40∶50∶5),飽和 2 h,上行層析 ,室溫展層6 h,取出后吹干,染色液 0.1%甲苯胺藍(lán),95%乙醇漂洗至背景褪色,吹干。

1.3.3.2 瓊脂糖凝膠電泳[8]膠濃度 0.6%,厚 3 mm;上樣液:純多糖溶液 20μL(10 mg/mL),10%甘油 5μL。指示劑:溴酚藍(lán)。電泳緩沖液:0.075 mol/L巴比妥緩沖液 (pH8.6);電壓:110 V,電泳 2 h,染色液 0.1%甲苯胺藍(lán);脫色液為乙醇∶水∶醋酸=5∶5∶0.1。

1.3.4 地木耳多糖的理化性質(zhì)

觀察地木耳多糖的顏色、狀態(tài)和溶解情況,并進(jìn)行化學(xué)性質(zhì)實驗,如茚三酮反應(yīng),Molish反應(yīng)、碘 -碘化鉀反應(yīng)、苯酚 -硫酸反應(yīng)。

1.3.4.1 茚三酮反應(yīng) 取 1.0 mL多糖水解液(1.0 mg/mL)于試管中,加茚三酮試劑 1.0 mL,在沸水中加熱 20 min,冷卻后觀察。分別取蒸餾水和小牛血清溶液(1.0 mg/mL)1 mL作為對照。

1.3.4.2 Molish反應(yīng) 取 1.0 mL樣品溶液 (1.0 mg/mL)于試管中,然后加 2滴 Molish試劑 (α-萘酚),搖勻。傾斜試管,沿管壁加入約 1 mL濃硫酸,小心豎直后,仔細(xì)觀察兩層液面交界處的顏色變化。以蒸餾水和淀粉(1.0 mg/mL)作為對照。

1.3.4.3 碘 -碘化鉀反應(yīng) 在白瓷板的凹孔中加入 200μL多糖樣品溶液 (1.0 mg/mL),滴加碘 -碘化鉀溶液 50μL觀察顏色的變化。以蒸餾水為陰性對照,0.5%的淀粉指示液為陽性對照。

1.3.4.4 苯酚 -硫酸反應(yīng) 取 1.0 mL多糖樣品溶液 (1.0 mg/mL)置試管中,加 5%的苯酚 -硫酸 600 μL,再加入濃硫酸 625μL,振蕩,觀察顏色的變化。以蒸餾水為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 地木耳多糖的提取

100 g地木耳干粉水提經(jīng) 7次 Sevage法除蛋白后可得到 13.75 g粗多糖,多糖得率為 13.75%,Sevage法脫蛋白 7次可脫除 94%的蛋白質(zhì)。

2.2 地木耳多糖的分離與純化

用DEAE-52纖維素陰離子交換色譜將地木耳多糖不同組分分離:粗多糖溶解上樣后,分別用蒸餾水、0.1～0.5 mol/L NaCl梯度洗脫,用苯酚 -硫酸法跟蹤檢測,洗脫曲線如圖1所示?？梢?分離效果較好,有明顯的 10個洗脫峰,且峰形比較對稱,分別代表10個組分 NCP1-10。根據(jù)峰面積大小,確定收集含量較多的組分 NCP3、NCP4、NCP5、NCP7,將這些組分合并濃縮,干燥待用。

圖1 洗脫曲線

2.3 地木耳多糖的純度鑒定

地木耳多糖洗脫組分經(jīng)過紙色譜后得到單一斑點,瓊脂糖電泳后是單一的條帶,而且不同的多糖之間的遷移率不同,從而說明分離純化的多糖是單一的多糖,而且是不同的多糖。

2.4 理化性質(zhì)分析

結(jié)果顯示,Molish反應(yīng)呈陽性,硫酸 -蒽酮反應(yīng)呈陽性,說明提取物為多糖;碘 -碘化鉀反應(yīng)呈陰性,說明為非淀粉多糖;茚三酮反應(yīng)呈陰性,說明樣品不含蛋白、多肽或氨基酸。

3 討 論

(1)多糖廣泛存在于植物、動物、微生物 (細(xì)菌和真菌)中,來源廣泛,其中研究較早的是從細(xì)菌中得到的各種莢膜多糖,它在醫(yī)藥上主要用于疫苗生產(chǎn)。近幾十年來,人們發(fā)現(xiàn)從植物中,特別是具有中國特色的中草藥中提取的多糖具有非常重要與特殊的生理活性,這些多糖參與了細(xì)胞的各種活動,具有多種多樣的生物學(xué)功能,如參與生物體的免疫調(diào)節(jié)功能、降血糖、降血脂、抗炎抗疲勞、抗衰老等[9]。但對于藻類多糖提取、分離純化及生物活性的研究,國內(nèi)目前較少報道。

(2)地木耳粉末經(jīng)過 60倍蒸餾水 90℃熱水每次 3 h浸提 5次后,經(jīng)過 Sevage法脫蛋白后多糖得率為 13.75,這比范群艷[10]等提取地木耳多糖的得率高,究其原因可能是地木耳采自于西北干旱地區(qū),生存環(huán)境惡劣,為了抵抗惡劣的生活環(huán)境其體內(nèi)的多糖含量增加;另外,提取次數(shù)增多、提取時間延長都能夠增加多糖的得率。

(3)多糖脫蛋白的方法有 Sevage法、三氯三氟乙烷法、三氯乙酸法、酶法等。Sevage法條件溫和,缺點是效率不高,一次只能去除少量蛋白質(zhì),必須重復(fù)多次操作 (一般要重復(fù) 5～7次左右),才可去除蛋白質(zhì),多糖因此而大量損失:三氯三氟乙烷法效率較高,但沸點較低,易揮發(fā),不宜大量使用;三氯乙酸法較為劇烈,往往會引起某些多糖的降解;酶法效率較高,但易使多糖 -蛋白質(zhì)的復(fù)合物分解,造成某些多糖 -蛋白質(zhì)復(fù)合物特有的生理活性降低[11]。本研究選用 Sevage法脫蛋白,實驗結(jié)果顯示,隨著脫蛋白次數(shù)的增加,地木耳多糖和蛋白質(zhì)的吸光值均有不同程度的下降,但是隨著脫蛋白次數(shù)的增加蛋白質(zhì)的含量逐漸平穩(wěn),因此本研究脫蛋白 7次,脫蛋白后,蛋白含量為脫蛋白之前的 6%,多糖損失為脫蛋白前的 86%,基本達(dá)到了脫蛋白的目的,如果再進(jìn)一步脫蛋白多糖損失會加大。

離子交換色譜是通過載體表面帶電基團(tuán)與樣品離子和淋洗離子進(jìn)行可逆交換、離子偶極作用和離子吸附實現(xiàn)色譜分離。不同的多糖在一定 pH條件下,所帶電荷不同,則可根據(jù)各多糖上電荷的差異而達(dá)分離目的,DEAE-纖維素常用作離子交換色譜的柱填充材料,對多糖進(jìn)行分離純化。本研究以 DEAE-纖維素為柱填充材料,對提取的地木耳多糖進(jìn)行純化,用蒸餾水、0.1～0.5 mol/L NaCl為洗脫劑洗脫后得到 10種洗脫組分,通過紙色譜和瓊脂糖凝膠電泳鑒定洗脫組分為單一的多糖組分,從而說明通過離子交換色譜可以對地木耳多糖達(dá)到很好的分離效果。

4 結(jié) 論

(1)采用水提醇沉法提取地木耳多糖,在用 60倍蒸餾水 90℃水浴浸提 5次,每次 3 h,得率為13.75%,提取液使用 Sevage法脫蛋白 7次可脫除94%的蛋白質(zhì),這樣可以減少多糖的損失。

(2)在地木耳多糖的分離純化過程中應(yīng)選擇較為溫和的條件,用水和不同濃度 NaC1溶液為洗脫劑,避免劇烈的條件使多糖發(fā)生降解。DEAE-52纖維素柱層析柱洗脫后得到 10種多糖組分,各個組分經(jīng)過紙色譜和瓊脂糖凝膠電泳純度鑒別后均為單一的多糖組分。

[1] 朱浩然.中國淡水藻志:第九卷[M].北京:科學(xué)出版社,2007:253.

[2] Potts M,Whitton B A.The Ecology of Cyanobatacteria[M].Netherlands:Kluwer Academic Pubishers,2000:465-504.

[3] 范群艷,吳向陽,仰榴青,等.地木耳的研究進(jìn)展 [J].常熟理工學(xué)院學(xué)報,2007,21(4):55-59.

[4] 楊 超,李景恩,邱增輝,等.香薷多糖的提取與純化研究[J].食品科學(xué),2009,30(18):99-101.

[5] 吳東儒.糖類的生物化學(xué)[M].北京:高等教育出版社,1993.

[6] 鐘 巖,潘浦群,王艷紅,等.苯酚 -硫酸法測定鮮人參中多糖含量[J].時珍國醫(yī)國藥,2008,19(8):1957-1958.

[7] 呂 燕,陳 顥,汪水娟,等.壇紫菜多糖分離純化和結(jié)構(gòu)分析[J].南京大學(xué)學(xué)報,2001,37(2):240-245.

[8] 張德華.夏枯草多糖的提取、分離與純化技術(shù)研究[J].生物學(xué)雜志,2006,23(3):39-41.

[9] 譚周進(jìn),謝達(dá)平.多糖的研究進(jìn)展[J].食品科技,2002(3):10-12.

[10] 范群艷,吳向陽,仰榴青.響應(yīng)面分析法優(yōu)化地木耳多糖提取工藝的研究[J].江蘇大學(xué)學(xué)報,2007,17:3:236-240.

[11] 毛 燕,王學(xué)利.毛竹葉枝多糖提取的對比研究[J].林產(chǎn)化工通訊,2001,35(2):11-13.