梁起保，鄒玉安，張曉麗，薛茜#，石會娟，李瑞羽

（1.河北北方學院，張家口市 075000；2.河北北方學院第一附屬醫(yī)院神經內科，張家口市 075000；3.河北張家口市電力物業(yè)管理公司門診部，張家口市 075000）

康腦液2號對腦缺血再灌注大鼠VEGF、Ang-1與微血管密度的影響Δ

梁起保1＊，鄒玉安2，張曉麗1，薛茜2#，石會娟1，李瑞羽3

（1.河北北方學院，張家口市 075000；2.河北北方學院第一附屬醫(yī)院神經內科，張家口市 075000；3.河北張家口市電力物業(yè)管理公司門診部，張家口市 075000）

目的：研究康腦液2號對腦缺血再灌注大鼠血管內皮生長因子（VEGF）、血管生成素-1（Ang-1）與微血管密度（MVD）的影響。方法：180只雄性SD大鼠隨機均分為正常組、假手術組、模型組與康腦液2號高、中、低劑量組。線栓法復制大鼠右側大腦中動脈閉塞模型。大鼠缺血2h，于再灌注1、3、7、14、21d，免疫組化法檢測各組大鼠VEGF、Ang-1的表達，HE染色觀察大鼠腦組織病理改變；再灌注21d后免疫熒光法標記細胞膜糖蛋白CD105，觀察新生血管，計算MVD。結果：與模型組比較，康腦液2號高、中、低劑量組病理變化更顯著，VEGF、Ang-1在每個時間點表達顯著增高，腦梗死周圍區(qū)域MVD顯著增大。結論：康腦液2號能改善腦缺血再灌注大鼠病理變化，保護梗死區(qū)域神經細胞，其機制可能與增加VEGF、Ang-1等促血管新生因子表達而促進腦壞死周圍區(qū)域血管新生有關。

康腦液2號；腦缺血再灌注損傷；血管內皮生長因子；血管生成素-1；微血管密度

腦卒中是臨床常見疾病，在當今生活及飲食習慣的影響下，該病有上升趨勢，是世界范圍內主要致死和致殘的疾病之一。腦血管疾病在我國是位居第三的致死因素，其中缺血性腦血管?。↖schemic cerebrovascular disease，ICVD）可占到56.6%～80%，患者總人數可達500萬～600萬，存活者有高致殘率，高達約75%[1]，故對ICVD的防治非常重要。本課題組主要通過研究經驗方康腦液2號對腦缺血再灌注大鼠血管內皮生長因子（VEGF）、血管生成素-1（Ang-1）與微血管密度（MVD）的影響來探索其對腦缺血再灌注大鼠的治療機制，從而為康腦液2號防治ICVD提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

電腦生物組織包埋機、電腦生物組織攤烤片機（浙江金華科迪儀器設備有限公司）；石蠟切片機、自動脫水機（美國Thermo公司）；BX60型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；顯微攝影裝置、E200型熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 試藥

康腦液2號由黃芪、當歸、川芎、三七、葛根、地龍、丹參、鉤藤（后下）等藥味組成（藥材購于河北北方學院第一附屬醫(yī)院，經河北北方學院第一附屬醫(yī)院薛茜副主任醫(yī)師鑒定為真品），冷水浸泡過夜，煎煮2次，濾出藥渣，將2次煎取的藥液混勻，文火分別濃縮成400%、200%、100%康腦液2號（每1mL分別含生藥4、2、1g），4℃貯藏，備用；多聚甲醛（美國Sigma公司）；大腦中動脈阻塞（MCAO）栓線（北京沙東生物技術有限公司）；兔抗大鼠一抗體及相應二抗、熒光TRITC標記的羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 動物

SPF級成年SD大鼠180只，♂，體重200～280g，購自北京大學醫(yī)學部動物中心（動物使用許可證號：SCXK（京）2006-0008）。

2 方法

2.1 模型的復制

根據Longa EZ等[2]改良的方法，線栓經右側頸外動脈插線建立右側MCAO法復制大腦缺血再灌注模型。

2.2 分組與給藥

將大鼠隨機分為正常（等體積生理鹽水）、假手術（等體積生理鹽水）、模型（等體積生理鹽水）與康腦液2號高、中、低劑量（28.6、14.3、7.15g·kg-1）組，缺血2h，從手術后12h開始ig給藥，每天1次，直至處死。

2.3 HE染色與VEGF、Ang-1蛋白標記

于再灌注每個時間點，取每組6只大鼠，10%水合氯醛（300mg·kg-1）ip麻醉，經左心室插管至升主動脈，依次灌入生理鹽水150mL、4%多聚甲醛200mL，前肢固定至肢體變硬，開顱取腦，于前囟前2mm至前囟后3mm切腦，切塊厚度5mm，置入4%多聚甲醛中固定12～24h，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。切片3μm，HE染色觀察腦梗死后病理變化，采用免疫組化法（S-P二步法，按說明操作）檢測VEGF及Ang-1蛋白表達。

2.4 MVD檢測

于再灌注后21d，TRITC標記細胞膜糖蛋白CD105顯示新生血管，簡要步驟如下：切片脫蠟至水，PBS沖2min×3，室溫5%BSA封閉10min，甩去多余液體，滴加CD105一抗，4℃過夜，PBS沖3min×3，加TRITC標記的二抗（1∶64），37℃1h，PBS沖洗2min×4，裱片，甘油封片。在發(fā)射波長550nm、濾光波長620nm熒光顯微鏡下觀察。切片經圖像分析儀分析系統(tǒng)處理，參照Weidner N[3]的方法進行MVD計數，每份標本均選5個高倍視野（200×）計數微血管數目，取平均值為該份標本的平均微血管數（MMVC），以MMVC/mm2表示MVD（200×/高倍視野等于0.0426mm2）。

2.5 統(tǒng)計學方法

實驗結果采用SPSS16.0版本進行處理，每組數據以±s表示。采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較用SNK法，P＜0.05為差異顯著。

3 結果

3.1 各組大鼠腦病理改變情況

光鏡下可見模型組梗死明顯，梗死主要位于基底節(jié)、皮質下白質和皮層，缺血區(qū)神經細胞明顯減少，殘存神經細胞胞體縮小變性，細胞核固縮，胞漿濃縮呈深伊紅染色，神經元纖維疏松，間質水腫明顯，血管減少?？的X液2號低劑量組可見梗死范圍縮小，水腫程度較輕，神經元形態(tài)改變也較輕，胞體完整，突起較清楚，基本保持完整，血管較模型組明顯增多。大鼠腦病理改變見圖1。

圖1 大鼠腦病理改變（HE，×100）A.正常組；B.康腦液2號低劑量組；C.模型組Fig1 Pathological change of cerebral tissue in rats（HE，×100）A.normal group；B.Kangnao liquidⅡ low dose group；C.model group

3.2 腦組織VEGF與Ang-1免疫組化結果

VEGF與Ang-1陽性表達可見胞漿呈棕黃色，可表達于神經細胞、膠質細胞與血管內皮細胞。正常組和假手術組表達較弱，模型組VEGF與Ang-1蛋白表達顯著增強（P＜0.01或

P＜0.05）。與模型組比較，康腦液2號高、中、低劑量組VEGF

與Ang-1表達顯著增高（P＜0.01或P＜0.05），VEGF表達高峰在7d，Ang-1表達高峰在14d。康腦液2號高、中劑量組顯著高于低劑量組（P＜0.05）。大鼠VEGF的表達結果見表1、圖

2；大鼠Ang-1的表達結果見表2、圖3。

3.3 大鼠腦MVD檢測結果

表1 大鼠VEGF的表達結果（±s）Tab1 Expression of VEGF in cerebral tissue of rat（s±s）

表1 大鼠VEGF的表達結果（±s）Tab1 Expression of VEGF in cerebral tissue of rat（s±s）

與正常組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組假手術組模型組康腦液2號高劑量組康腦液2號中劑量組康腦液2號低劑量組21d 5.35±2.785.45±2.4217.11±2.81＊＊22.32±2.33#22.13±2.19#19.20±2.96#VEGF/個數n 6666661d 5.34±2.815.86±2.439.23±2.45＊10.25±2.3310.36±2.3110.25±2.013d 5.35±2.245.97±1.8816.35±3.18＊＊29.25±4.04##28.96±3.88##22.66±3.32##7d 5.35±2.876.16±2.3232.51±3.54＊＊54.37±4.65##55.09±4.74##48.22±3.09##14d 5.36±2.015.88±1.2920.19±3.21＊＊34.52±4.21##33.82±4.02##30.01±3.89##

陽性血管表達呈紅色。正常組與假手術組陽性血管表達較少；模型組MVD顯著高于正常組（P＜0.01）。與模型組比較，康腦液2號高、中、低劑量組MVD顯著增高（P＜0.01或P＜0.05），康腦液2號高、中劑量組促血管新生能力顯著強于低劑量組（P＜0.05）。大鼠腦MVD的比較結果見表3；大鼠新生血管的表達見圖4。

4 討論

圖2 大鼠VEGF的表達（免疫組化，×400）A.正常組；B.康腦液2號低劑量組；C.模型組Fig2 Expression of VEGF in cerebral tissue of rats（immunohistochemistry，×400）A.normal group；B.Kangnao liquidⅡ low dose group；C.model group

腦缺血后引起一系列的級聯(lián)反應，包括炎癥反應、自由基超載、毒性氨基酸釋放等，但歸根結底無非是腦缺血缺氧導致，如果能早期恢復血供則可實現讓腦組織自己搭橋的夢想。臨床工作中早期組織型纖溶酶原激活劑（T-PA）溶栓顯示出較好的臨床效果，證實了及時恢復血供、建立側枝循環(huán)對治療腦缺血的重要性。但T-PA溶栓指征苛刻，臨床上適合溶栓的患者非常少，所以開發(fā)能促進腦缺血周圍組織血管新生的藥物成為治療ICVD的重要策略。血管新生是在缺血組織已有的血管床上，內皮細胞以牙生的方式長出新支，形成血管網，使其功能與局部的需要相適應的生物學過程，主要靠促血管新生因子來促使其生成。VEGF是迄今發(fā)現最重要的一種促血管生成因子，其一方面能高選擇地促進血管內皮的有絲分裂，進而促進血管內皮的新生；另一方面，其還能增加血管內皮的通透性，使血漿大分子物質滲透到血管外的基質中，從而為新生的血管提供營養(yǎng)物質[4]。Ang-1在血管新生過程中也發(fā)揮著重大作用，主要機制如下：（1）使血管內皮細胞趨化、聚集，吸引周圍細胞形成新生血管；（2）拮抗內皮細胞凋亡；（3）促進血管內皮細胞遷移和形成管狀結構，加強VEGF等的血管穩(wěn)定作用；（4）調節(jié)內皮細胞和血管平滑肌細胞，促進血管重塑、成熟，維持血管的完整性和穩(wěn)定性[5]。

表2 大鼠Ang-1的表達結果（±s）Tab2 Expression ofAng-1in cerebral tissue of rat（s±s）

表2 大鼠Ang-1的表達結果（±s）Tab2 Expression ofAng-1in cerebral tissue of rat（s±s）

與正常組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組假手術組模型組康腦液2號高劑量組康腦液2號中劑量組康腦液2號低劑量組Ang-1/個數n 6666661d 5.06±3.015.16±2.108.24±2.54＊8.26±2.528.36±2.488.25±2.013d 5.05±2.225.17±1.9811.25±3.63＊＊19.96±3.64##19.26±3.69##18.64±3.22##7d 5.05±2.975.16±2.5513.88±3.21＊＊20.08±3.55##20.19±3.64##18.22±3.17##14d 5.08±2.215.18±1.2920.19±5.01＊＊41.54±5.11##40.02±5.12##32.01±4.62##21d 5.06±2.965.15±3.1212.11±3.21＊＊14.21±2.22#14.22±2.28#14.20±2.21#

圖3 大鼠Ang-1的表達（免疫組化，×400）A.正常組；B.康腦液2號低劑量組；C.模型組Fig3 Expression of Ang-1in cerebral tissue of rats（immunohistochemistry，×400）A.normal group；B.Kangnao liquidⅡ low dose group；C.model group

表3 大鼠腦MVD的比較結果（±s，血管數/mm2）Tab3 Comparison of MVD in cerebral tissue of rat（s±s，MMVC/mm2）

表3 大鼠腦MVD的比較結果（±s，血管數/mm2）Tab3 Comparison of MVD in cerebral tissue of rat（s±s，MMVC/mm2）

與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組假手術組模型組康腦液2號高劑量組康腦液2號中劑量組康腦液2號低劑量組n 666666缺血再灌注21d 8.13±0.987.98±1.4338.22±3.25＊50.39±4.80##50.20±4.66##44.11±4.24#

圖4 大鼠新生血管的表達（×100）A.正常組；B.康腦液2號低劑量組；C.模型組Fig4 Expression of CD105of rats（×100）A.normal group；B.Kangnao liquidⅡ low dose group；C.model group

CD105不與大血管的內皮細胞反應，但對新生血管反應性強，即與“活化”的內皮細胞反應性強，而對組織中正常的靜止狀態(tài)下的血管內皮細胞反應性弱[6]。本研究利用免疫熒光標記技術標記CD105，能更好地顯示新生血管，更具有說服力。

ICVD屬于中醫(yī)的中風范疇，其主要病機為“素體氣虛，不能行血，以致血瘀”，所以治療原則主要為“益氣活血化瘀”。康腦液2號是臨床使用多年的經驗方，適合氣虛血瘀患者，由益氣活血的鼻祖方補陽還五湯按照現代人的特點化裁而來，由黃芪、當歸、川芎、葛根、地龍、三七、丹參、鉤藤等組成。方中君藥以大量黃芪大補脾胃元氣，使得氣旺血行，瘀去絡通，并且活血祛瘀而不傷正；當歸善于活血養(yǎng)血，有化瘀而不傷血之妙，并和黃芪1∶5配伍為當歸補血湯，充養(yǎng)脈絡，是為臣藥；川芎、葛根、地龍、三七、丹參等助當歸活血化瘀，為佐藥；鉤藤、天麻引藥上行，是為使藥，君臣佐使共奏補氣活血化瘀之功。益氣活血法治療缺血再灌注損傷研究較多，嚴彬等[7]利用補氣活血中藥治療腎缺血再灌注模型大鼠，效果較好。更有田兆華等[8]研究證實，益氣活血代表方補陽還五湯能明顯增多缺血腦組織新生血管數目。其余各單藥對腦梗死的治療作用也均有研究，有的已經在臨床使用，比如川芎、丹參、葛根、三七等。

綜上所述，康腦液2號能增加MCAO大鼠VEGF、Ang-1的表達，促進缺血腦組織血管新生，這可能是康腦液2號治療ICVD的機制所在。

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Effects of Kangnao Liquid Ⅱ on VEGF，Ang-1and MVD of Rats with Focal Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

LIANG Qi-bao，ZHANG Xiao-li，SHI Hui-juan
（Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China）
ZOU Yu-an，XUE Qian
（Dept.of Neurology，The First Affiliated Hospital of Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China）
LI Rui-yu
（Outpatient Department of Zhangjiakou Power Estate Management Company of Hebei Province，Zhangjiakou 075000，China）

OBJECTIVE：To investigate the influences of Kangnao liquid Ⅱ on vascular endothelial growth factor（VEGF），angiogenin-1（Ang-1）and MVD in rats with focal cerebral ischemia reperfusion injury.METHODS：180healthy male SD rats were randomly divided into normal group，sham operation group，model group，Kangnao liquid Ⅱ high-dose，medium-dose and low-dose groups.Middle cerebral artery occlusion model was induced using suture method.Pathological changes were detected by HE staining and immunohistochemical method was used to investigate the expression of VEGF and Ang-1in rats on 1d，3d，7d，14d，21d of reperfusion injury after ischemia for 2h.Immunofluorescence labeling method was used to mark neovascular CD105after 21d of reperfusion and calculate MVD.RESULTS：Compared with model group，pathological changes of Kangnao liquidⅡhigh-dose，medium-dose，low-dose groups was better than that of model group.The expressions of VEGF and Ang-1increased at different time points significantly.MVD of cerebral infarction area was significant bigger than that of model group.CONCLUSION：Kangnao liquidⅡcan improve pathological change of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury and protect nerve cells of cerebral infarction focus.It may be associated with Kangnao liquidⅡcan increase the expression of VEGF and Ang-1to promote tissue angiogenesis.

Kangnao liquidⅡ；Cerebral ischemia reperfusion injury；Vascular endothelial growth factor；Angiogenin-1；MVD

R285；R97

A

1001-0408（2011）19-1740-04

Δ河北省醫(yī)學科學研究重點課題（20090591）

＊碩士研究生。研究方向：缺血性腦血管疾病的用藥。E-mail：liangqibaoyisheng@126.com

#通訊作者：副主任醫(yī)師，副教授。研究方向：缺血性腦血管疾病。E-mail：xueqian6166@163.com

2010-10-17

2011-01-19）