石雪萍,張衛(wèi)明,張鳴鏑,關(guān)榮琴

(1.南京野生植物綜合利用研究院,江蘇南京 210042;2.吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130062)

花椒 (Zan thoxylum bungeanum Maxim.),屬蕓香科 (Rutaceae)花椒屬植物[1],是傳統(tǒng)的調(diào)味料和中藥。花椒的化學(xué)成分主要有揮發(fā)油、生物堿、酰胺、木脂素、香豆素和脂肪酸等[2]。花椒的果實(shí)、根、莖和葉均可入藥,《中國(guó)藥典》記載,花椒有“溫中止痛,殺蟲止癢”的功效。民間有用花椒煎水外洗,常配苦參、蛇床子、白蘚皮等,以清熱燥濕止癢,用于濕疹瘙癢,陰癢[3]。生物堿是花椒屬植物中普遍含有的一類物質(zhì),這些生物堿按其母核可分為四大類:喹啉衍生物類、異喹啉衍生物類、苯并菲啶衍生物類和喹諾酮衍生物類[4-5]。普遍存在于花椒屬中的茵芋堿具有鎮(zhèn)痛、解痙和鎮(zhèn)靜作用[6]。本研究通過(guò)大孔樹脂純化花椒總生物堿,并采用小鼠熱板法探索其鎮(zhèn)痛作用,并研究了花椒生物堿的抗炎、止癢作用,旨在促進(jìn)花椒綜合利用技術(shù)的發(fā)展,為花椒的進(jìn)一步研究開發(fā)提供理論依據(jù),從而擴(kuò)大其在外用藥、化妝品等方面的應(yīng)用,推動(dòng)我國(guó)花椒產(chǎn)業(yè)化步伐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物樣品

花椒,產(chǎn)地四川茂汶,經(jīng)南京野生植物院肖正春教授鑒定為蕓香科植物花椒 (Z.bungeanum M axim.)品種。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小鼠,普通級(jí),體重 25～28 g,雌雄兼用,由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供 [動(dòng)物合格證號(hào)SCSK(蘇)2007-0008];受試動(dòng)物受試前適應(yīng)環(huán)境5 d,自由攝食、飲水。

1.1.3 藥物與試劑

阿司匹林泡騰片,批號(hào) 0909048,阿斯利康制藥有限公司;生理鹽水,自制,高壓濕熱滅菌 (121℃,20 m in),備用。復(fù)方醋酸地塞米松乳膏,批號(hào)090801,湖北科田藥業(yè)有限公司;醋酸氟輕松乳膏,批號(hào) 100322,天津太平洋制藥有限公司;低分子右旋糖酐 -40(Dextranum-4),批號(hào) 060924,陜西西康樂制藥廠;二甲苯,南京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花椒生物堿的制備

將花椒果皮粉碎后稱取 1 000 g,加入 pH 3的70%乙醇,料液比 1∶10,在 60℃提取 4 h,減壓回收乙醇[10],水提液用氨水調(diào) pH至 9～10,置于 4℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用NKA-9大孔樹脂先分別以水和50%乙醇洗脫除去水溶性雜質(zhì),再用 70%乙醇反復(fù)洗脫至無(wú)生物堿特征反應(yīng),洗脫液減壓濃縮得大孔樹脂洗脫物 23.6 g。

1.2.2 小鼠熱板法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)[7-9]

用分析天平準(zhǔn)確稱取純化后的花椒生物堿,無(wú)菌生理鹽水配制成高、中、低 3種濃度梯度供試液,每毫升分別相當(dāng)于生藥 472 m g、236 m g、118 m g。取雌性小鼠 50只,隨機(jī)分為對(duì)照組,花椒生物堿高、中、低濃度供試液組及阿司匹林組共 5組,每組 10只。每組小鼠分別灌胃給藥,給藥容積均為 0.2 mL/10 g,對(duì)照組灌胃等容積生理鹽水,連續(xù)給藥 3天。末次給藥 30 m in后,用秒表記錄小鼠自投入恒溫水浴的燒杯中[溫度控制在 (55±0.5)℃]至出現(xiàn)舔后足的時(shí)間(s)作為該鼠的痛閾值。剔除痛閾值小于 5 s、大于 30 s或出現(xiàn)跳躍反應(yīng)的小鼠。記錄給藥后 30 m in,60 m in,90 m in時(shí)的痛閾值,如痛閾超過(guò) 60 s,按 60 s計(jì),并比較組間差異。

1.2.3 對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響[10-13]

取 1.2.1節(jié)制備的花椒生物堿,用 70%乙醇配制為高、中、低 3種濃度供試液,每毫升分別相當(dāng)于生藥 94.4 m g、47.2 m g、23.6 m g。

雄小鼠 50只,分為 5組,即溶劑組,高、中、低濃度花椒生物堿供試液 (和復(fù)方醋酸地塞米松組,每組 10只。實(shí)驗(yàn)前 2 d小鼠右耳涂藥 2次,涂藥間隔6 h,實(shí)驗(yàn)當(dāng)日涂藥 1次,30μL/次,涂藥時(shí)先將小鼠用乙醚麻醉。末次涂藥后 30 m in,在小鼠右耳正反面涂布致炎劑二甲苯 25μL/只,左耳作對(duì)照,40 m in后頸椎脫臼處死小鼠,沿耳廓基線立即剪下雙耳,用7 mm打孔器分別在雙耳同一部位打下圓耳片,精密稱重,右耳重量減去左耳重量為腫脹度,比較各組腫脹度值,同時(shí)計(jì)算腫脹抑制率。

腫脹抑制率(%)=(溶劑組腫脹度 -花椒生物堿供試液或陽(yáng)性對(duì)照組腫脹度)/溶劑組腫脹度 ×100%

1.2.5 對(duì)低分子右旋糖酐 -40誘發(fā)小鼠皮膚瘙癢的影響[14-15]

將小鼠 50只,雌性,隨機(jī)分為對(duì)照組,花椒生物堿高、中、低濃度供試液組及氟輕松組共 5組,每組10只。實(shí)驗(yàn)前 2 d用脫毛劑將小鼠背部脫毛,脫毛面積約為 9 cm2,然后分別將藥物均勻涂擦于脫毛區(qū),模型對(duì)照組擦等量生理鹽水,每天涂 2次,共 5次。末次涂藥 30 m in后,向各組小鼠鼠尾靜脈注射0.025%右旋糖苷 -40(1.25 m g/m L)。以小鼠前爪搔抓頭部,后爪搔抓軀干,啃咬全身各部位作為瘙癢特征。觀察記錄首次搔抓的時(shí)間 (潛伏時(shí)間)及 30 m in內(nèi)瘙癢次數(shù)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 花椒生物堿對(duì)熱板法小鼠疼痛反應(yīng)的影響

按照 1.2.4節(jié)方法,采用小鼠熱板法考察花椒生物堿的鎮(zhèn)痛作用,結(jié)果見表2。

表1 花椒生物堿對(duì)熱板法引起小鼠疼痛的影響 ±s,n=10)

表1 花椒生物堿對(duì)熱板法引起小鼠疼痛的影響 ±s,n=10)

與對(duì)照組比較,＊ P<0.05,＊＊ P<0.01。

組別 劑量 C/mg·kg-1給藥后不同時(shí)間段小鼠痛閾/s 30 m in 60 m in 90 m in對(duì)照組 - 11.72±3.22 1±2.32 31±1.45阿司匹林 200 13.79±1.93 ±170±3.33＊＊花椒生物堿 (低) 118 13.1±213.30±2.20花椒生物堿 (中) 236 17.0.63±2.80＊＊ 17.00±2.74＊＊花椒生物堿 (高) 472 136±2.30＊＊ 17.17±3.51＊＊ 17.19±3.06＊＊

表1的試驗(yàn)結(jié)果表明,阿司匹林組 60 m in明顯提高熱板法小鼠的痛閾值,與空白組比較差異具有顯著性 (P<0.05)?；ń飞飰A低劑量組對(duì)小鼠鎮(zhèn)痛作用不明顯,表現(xiàn)為疼痛閾值沒有顯著變化。高、中劑量組均能顯著提高小鼠對(duì)熱的痛閾值,且在 30 m in時(shí),就能表現(xiàn)出比阿司匹林組更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛效果,持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),與對(duì)照組比較差異顯著 (P<0.01)。以上結(jié)果顯示,花椒生物堿對(duì)小鼠熱刺激引起的疼痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用。

2.2 花椒生物堿對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響

表2 花椒生物堿對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹度的影響 ±s,n=10)

表2 花椒生物堿對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹度的影響 ±s,n=10)

與對(duì)照組比較,＊ P<0.05,＊＊P<0.01。

組別 腫脹度/m·mg-1 抑制率/%對(duì)照組 7.17±2.14 -復(fù)方醋酸地塞米松組 2.33±0.82 67.50＊＊花椒生物堿 (高) 4.17±1.47 41.84＊＊花椒生物堿 (中) 5.67±0.52 20.92＊花椒生物堿 (低) 6.33±0.52 11.72

表2結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,高濃度花椒生物堿供試液對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹有較顯著的抑制作用 (P<0.01),腫脹抑制率為 41.84%;中濃度花椒生物堿對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹抑制作用較顯著(P<0.05),腫脹抑制率為 20.92%,低濃度的花椒生物堿對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹抑制作用不顯著,抑制率為 11.72%。此結(jié)果說(shuō)明了一定濃度的花椒生物堿具有一定的抗炎作用。

2.3 花椒生物堿對(duì)小鼠皮膚瘙癢的止癢作用

表3 花椒生物堿對(duì)小鼠皮膚瘙癢的止癢作用 ±s,n=10)

表3 花椒生物堿對(duì)小鼠皮膚瘙癢的止癢作用 ±s,n=10)

與對(duì)照組比較,＊ P<0.05,＊＊ P<0.01。

組別 潛伏時(shí)間/s 瘙癢次數(shù)/次對(duì)照組 117±18 61.50±5.58氟輕松組 273±19 26.33±1.63＊＊花椒生物堿 (高) 215±30 33.00±4.20＊＊花椒生物堿 (中) 202±19 44.50±4.04＊花椒生物堿 (低) 160±30 54.17±4.58

表3結(jié)果表明,花椒生物堿具有減輕小鼠瘙癢癥狀的功能。氟輕松組和高濃度的花椒生物堿止癢作用明顯(P<0.01),中濃度劑量的花椒生物堿止癢作用較顯著(P<0.05),低劑量的花椒生物堿幾乎沒有止癢作用。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用熱板法研究花椒生物堿的鎮(zhèn)痛效果,結(jié)果表明,花椒生物堿對(duì)小鼠熱刺激引起的疼痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用,能延長(zhǎng)熱痛反應(yīng)中小鼠舐后足的時(shí)間,其作用呈一定的量效關(guān)系;二甲苯致炎法及低分子右旋糖酐 -40誘發(fā)小鼠皮膚瘙癢研究花椒生物堿抗炎、止癢作用,結(jié)果顯示花椒生物堿能較強(qiáng)抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹,并能輕微緩解分子右旋糖酐 -40誘發(fā)的小鼠皮膚瘙癢。由此可見,花椒生物堿具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛、抗炎、止癢作用,有待進(jìn)一步開發(fā)研究。

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