鐘菲菲，章建輝，李 樂，賴燈妮，彭新凱，胡朝暉

（長沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心，湖南 長沙 410018）

2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）是一種較使用廣泛的化學藥品[1]。高濃度2,4-D可以用作除草劑；低濃度2,4-D可作植物生長調(diào)節(jié)劑，因此被廣泛的應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。2,4-D作為植物生長調(diào)節(jié)劑能提高坐果率、增大果實[2]；還有果實保鮮作用[3]；并能促進植物生根、調(diào)節(jié)細胞生長[4]，誘導根瘤的形成[5]。2,4-D的水溶性較高，揮發(fā)性較低，在自然界中難以生物降解或直接光解，導致2,4-D易于淋溶遷移進入水體[6]和土壤，進而在生物體內(nèi)積累，對生物具有較高的急性毒性，在較高劑量時具有致畸性和潛在的基因毒性，對人類健康和自然生態(tài)環(huán)境都有較大危害[7]。2,4-D在植物體中的含量低及本身的特殊化學性質(zhì)使得2,4-D的檢測要求高，而目前的檢測方法存在操作復雜、靈敏度不高、干擾大或?qū)悠非疤幚硪蟾?、樣品需求量大等問題，因此迫切需要尋找檢測2,4-D的新途徑。

筆者利用自組裝技術(shù)和靜電吸附作用，將2,4-二氯苯氧乙酸抗體（anti-2,4-D）固定在由自組裝L-半胱氨酸和靜電吸附納米金修飾的金電極表面，制備出無試劑型的免疫傳感器，用于2,4-D的檢測分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CHI660C電化學工作站，金電極，Ag/AgCl飽和電極和鉑絲電極均由上海辰華儀器公司提供；2,4-二氯苯氧乙酸抗體（anti-2,4-D）由北京博奧森生物公司提供；電子天平，超聲清洗儀和離心機由上海生化工程試劑公司提供；2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），BSA，氯金酸和L-半胱氨酸由Sigma公司提供；H2O2（30%，水溶液）和其他試劑均為分析純試劑；試驗用水為二次蒸餾水。

1.2 免疫傳感器的制備

參照文獻[8]制備免疫傳感器。金電極（∮＝2 mm）分別用 1.0、0.3、0.05 μm 的 Al2O3粉拋光，然后分別用乙醇、水超聲波清洗5 min，吹干后待用。將洗凈過的金電極放入0.02 mol/L的L-半胱氨酸溶液中，開路自組裝2 h，取出洗凈后，將金電極浸入納米金溶液中4℃過夜，取出后洗凈晾干，即在電極的表面形成自組裝納米金修飾膜，將修飾好的電極置于anti-2,4-D溶液中37℃保持3 h，再用1%BSA封閉電極表面非特異性結(jié)合位點，用水洗滌，晾干，即得無試劑免疫傳感器。

1.3 免疫檢測與分析方法

將2,4-D溶液滴加在免疫電極表面，于37℃條件下孵育30 min，然后用水仔細清洗后待測。試驗采用三電極系統(tǒng)：免疫電極為工作電極，鉑絲電極為對電極，Ag/AgCl飽和電極為參比電極，以交流阻抗法作為免疫傳感器表征和定性定量的判定方法。在 5 mmol/L K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]+0.1 mol/L KCl+0.1 mol/L PBS（pH 7.0）溶液中，電位為 0.231 V，頻率范圍為0.05～106 Hz，交流電位為5 mV，25℃條件下進行交流阻抗表征。

1.4 阻抗分析原理

組裝好的阻抗免疫電極與Ag/AgCl電極和鉑絲電極構(gòu)建的三電極系統(tǒng)浸入5 mL的含K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]的阻抗檢測液中。在阻抗圖譜測試參數(shù)下進行，一次測定中進行兩次阻抗檢測：2,4-D抗體吸附到電極表面后用BSA封閉多余蛋白吸附位點，此時檢測阻抗，記為Z0；加入待測2,4-D后，在電極表面形成2,4-D—2,4-D抗體復合物后檢測阻抗，記為Z1。則添加抗原后傳感器阻抗的增長率為：

不同濃度的2,4-D對應(yīng)不同的△Z/Z0，通過已知濃度的2,4-D和對應(yīng)的△Z/Z0作出標準曲線可以對未知樣品進行測定。為獲得阻抗免疫傳感器穩(wěn)態(tài)下的阻抗值，同一狀態(tài)下的電極被反復測定3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感器在制備過程中的交流阻抗表征

采用交流阻抗（EIS）表征電極修飾過程，將電極在修飾過程中于5 mmol/L K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]+0.1 mol/L KCl+0.1 mol/L PBS（pH 值7.0）溶液中的交流阻抗表征如圖1。裸電極時電子傳遞到電極表面只受到擴散控制，裸電極的EIS近似一條直線如圖1-a。當電極修飾了L-半胱氨酸和納米金后，交流阻抗的膜本體阻抗依次增大，如圖1-b、c，說明電極表面已通過靜電吸附成功地被修飾。納米金修飾的金電極表面掃描電鏡圖見圖2。當修飾的電極固定anti-2,4-D，并用BSA封閉非特異性結(jié)合位點后，電極的界面阻力再度增加，電極修飾過程交流阻抗的變化是抗體已經(jīng)被組裝到電極表面的有力證據(jù)，如圖1-d。當電極進一步結(jié)合不同濃度的2,4-D后，其阻抗呈增大趨勢（圖1-e），這是因為抗原—抗體復合膜的形成，一方面增大了Fe（CN）63-/4-在通過膜時的阻力，另一方面，也使Fe（CN）63-/4-向電極表面擴散的有效截面積進一步變小，從而導致膜本身阻抗的增大。

2.2 anti-2,4-D吸附時間的優(yōu)化

為得出最佳狀態(tài)的工作傳感技術(shù)，獲得準確的檢測結(jié)果，需要使電極在較短的時間里吸附到最好的具有生物活性且固定量大的2,4-D抗體，對anti-2,4-D 的吸附時間進行了優(yōu)化，共設(shè)置 1、2、3、4、5、6 h共6個處理。如圖3所示，在作用1、2 h后，所測得的阻抗變化值不大，說明anti-2,4-D吸附到電極表面上的量不大，還不能滿足試驗要求；當作用 3、4、5、6 h后，阻抗變化值逐漸加大；說明吸附在電極表面上anti-2,4-D的量也是越來越多。在本試驗中，電極表面上anti-2,4-D的吸附量并不是越多越好，而是要確定一個量，而這個量，既能有較大量的生物活性的識別物質(zhì)又能便于結(jié)果的分析，通過試驗可看出，在吸附3 h后，anti-2,4-D的量即可滿足試驗的要求。因此，本試驗選取了3 h為最佳anti-2,4-D吸附時間。

圖3 anti-2,4-D吸附時間的影響

2.3 2,4-D與anti-2,4-D作用時間的優(yōu)化

試驗通過對2,4-D與anti-2,4-D的作用時間的優(yōu)化，來確定抗原與抗體免疫反應(yīng)的最佳程度。設(shè)置 5、15、30、45、60和 80 min共 6個時間。將 16 μL的2,4-D溶液滴加在固定了anti-2,4-D的電極表面上，在37℃下作用于設(shè)置的時間后，雙蒸水清洗，室溫下吹干，測阻抗值。如圖4所示，作用30 min前，阻抗值隨反應(yīng)時間的增加而增加；當作用時間為30 min時，結(jié)合反應(yīng)達到基本飽和程度，而后，隨作用時間的延長，反應(yīng)基本沒有很大的變化，阻抗響應(yīng)變化非常小。因此，選取了30 min作為2,4-D與anti-2,4-D的最佳作用時間。

圖4 2,4-D與抗體作用時間對阻抗變化的影響

2.4 檢測工作液pH值的影響

檢測工作液 pH 值分別為 5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、7.8和8.2時阻抗值的變化如圖5所示。在pH值5.8到8.2這個區(qū)間內(nèi)，阻抗值先升高后降低，在pH值7.0的時候阻抗值達到最高。這說明在此區(qū)間內(nèi)，免疫電極在pH值7.0的時候時工作環(huán)境達到最理想。這與2,4-D—anti-2,4-D結(jié)合物置于pH值7.0的環(huán)境中能更穩(wěn)定地保持在修飾電極上有關(guān)。在中性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子的表面張力最大，處于一種微弱的水化狀態(tài)，較易吸附于金顆粒的表面，處于穩(wěn)定狀態(tài)，與普通蛋白質(zhì)一樣。2,4-D—anti-2,4-D結(jié)合物在酸性條件下可能會發(fā)生變性，從而影響正常的抗原—抗體免疫結(jié)合物的穩(wěn)定性。因此免疫傳感電極最理想的pH值為7.0。

圖5 不同pH值對2,4-D與抗體反應(yīng)的影響

綜合條件優(yōu)化試驗得出，檢測2,4-D的無試劑型免疫傳感器的最佳工作條件為：anti-2,4-D吸附時間為3 h；2,4-D與anti-2,4-D最佳作用時間為30 min；檢測工作液最佳pH值為7.0。后續(xù)試驗都在這個條件下進行。

2.5 標準曲線的制備

在確定免疫傳感器最優(yōu)參數(shù)后，對濃度為1～5 000 ng/mL的2,4-D進行測試，并繪制標準曲線。測試結(jié)果如圖6所示，從圖中可看出：當修飾的電極結(jié)合不同濃度的2,4-D，電極的界面阻力不同程度的增加，2,4-D的濃度越大，電極的界面阻力的增加程度越大，免疫傳感器的響應(yīng)信號——交流阻抗越大，從而得到一系列的阻抗曲線。

圖7 在含 5 mmol/L K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]的阻抗液中2,4-D濃度范圍在1～5000 ng/mL繪制的Nyquist圖（Zim vs.Zre），試驗均在最優(yōu)化條件下進行。

由圖7可知，免疫傳感器阻抗值的變化與溶液中2,4-D濃度成正比，阻抗變化率（y）與2,4-D濃度（x）在2,4-D濃度為1～5 000 ng/mL范圍內(nèi)成線性關(guān)系，回歸方程是y=0.024 6 x+55.092，相關(guān)系數(shù)R2為0.998 6。根據(jù)3倍空白標準偏差的方法，該免疫阻抗免疫傳感器的的檢測下限為0.5 ng/mL。

2.6 樣品的測定

2.6.1 方法回收率的測定 以0.1 mol/L PBS（pH值7.0）為稀釋液，把標準2,4-D抗原配制成不同濃度的待測品，將該免疫電極置于樣品溶液中培育30 min后，優(yōu)化條件下測定阻抗值，求得待測品中2,4-D的濃度，并得到此方法的回收率在92.0%～102.7%之間。

2.6.2 實際樣品的應(yīng)用 利用該免疫傳感器對芒果、豆芽、草莓、香橙等5個樣品中2,4-D含量進行測量，并與應(yīng)用普遍的國家標準方法——液相色譜（HPLC）的結(jié)果進行比較，結(jié)果中兩方法的誤差率均在實驗規(guī)范要求之內(nèi)（≤10%），具體結(jié)果見表1。

表1 樣品測試結(jié)果

3 結(jié)論

利用納米金固定2,4-二氯苯氧乙酸抗體（anti-2,4-D）的免疫傳感器直接測定2,4-D。試驗結(jié)果表明：在2,4-D濃度為1～5 000 ng/mL范圍內(nèi)響應(yīng)值與濃度成線性關(guān)系，線性方程是y=0.024 6 x+55.092，相關(guān)系數(shù)R2達0.998 6，檢測下限為0.5 ng/mL。經(jīng)初步應(yīng)用，證實此方法能較好的滿足測定2,4-D的需要，是一種快速檢測2,4-D的新途徑。

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