邱康俊，胡漢峰，胡凝，江曉東，顧松山

(1.南京信息工程大學大氣物理學院，江蘇南京210044;2.安徽省氣象局大氣探測技術保障中心，安徽合肥230031;3.南京信息工程大學應用氣象學院，江蘇南京210044)

0 引言

生物技術進步推動農(nóng)業(yè)科技革命和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)快速發(fā)展，通過基因重組，將控制優(yōu)良性狀基因按照人類需要轉移到相應作物，進而培育出具有抗蟲、耐濕、耐旱等優(yōu)良性狀的新品種。自1983年第一例轉基因煙草成功培植，轉基因作物發(fā)展迅速。目前轉基因研究至少在35科200種植物中獲得成功，轉基因作物在全世界20多個國家種植，并且其商業(yè)栽培面積是20世紀90年代的50倍(胡平等，2006;陳興玲等，2007)。

轉基因作物帶給人類巨大利益的同時，還存在著難以預知的潛在威脅(Jia，2004;胡平等，2006)。一是轉基因作物本身與其野生種的生存競爭和“雜草化”;二是抗性基因轉移是否會產(chǎn)生“超級害蟲”、“超級病害”;三是對生物多樣性及生態(tài)平衡的影響。自然界中，植物花粉是各種控制遺傳性狀基因的有效載體，即作物基因通過花粉進行轉移和傳播?；ǚ蹟U散主要途徑是花粉逃逸，還包括動物攜帶擴散及昆蟲采粉擴散等。隨著轉基因作物日益增多，轉基因花粉釋放逃逸面積不斷擴大，導致各種轉基因花粉地理分布及生長空間重疊，產(chǎn)生不可預知的基因危害。

為此需要研究轉基因作物花粉逃逸規(guī)律(Song et al.，2004;Wang et al.，2006;Yuan et al.，2007)，考察種和種之間從花期、傳粉受精、胚胎發(fā)育到結實全過程的生物特性和相互間的親和性(宋小玲等，2005)，探明各種轉基因逃逸情況，建立量化風險評估體系(錢迎倩等，1998;朱琳和佟玉潔，2003;Jia，2004;陳興玲等，2007)。首先要了解自然環(huán)境中轉基因花粉在三維空間分布及其隨時間演變情況。另外基因花粉逃逸與地球近地面邊界層大氣內的溫度、濕度、風向、風速等大氣物理參數(shù)及其變化有關。在下風方向，花粉逃逸最大距離隨著風速的增大而增大(Song et al.，2004)，并且單位面積花粉密度分布規(guī)律與風向風速大氣穩(wěn)定度等氣象條件有一定關系(陳萬隆和肖靜芬，1995;Song et al.，2004;Hu et al.，2007;魏玉香等，2009)。建立轉基因花粉逃逸安全性定量數(shù)學模型(Hu et al.，2007;楊穎，2007;Yao et al.，2008;羅蔣梅等，2009)，加入各種大氣物理參數(shù)及其變化梯度。因此“實時”采集轉基因花粉對研究基因花粉逃逸規(guī)律及建立量化風險評估體系有著重要意義。

1 儀器原理

1.1 工作原理

目前采集轉基因花粉主要有兩種方法，一是1943年Durham提出的自然重力收集法，將涂有粘合劑的載玻片，按照一定空間規(guī)律放置于轉基因作物實驗田中直接進行花粉采集(李仁忠等，2007;劉壽東等，2008;趙莉莉等，2009)，其原理是隨風飄散的花粉在其自身重力作用下被載玻片捕獲。二是基于空氣流體連續(xù)性，通過一定的方法使轉基因花粉隨空氣流過采樣介質被粘合劑所捕獲。20世紀50年代初，Hirst發(fā)明通風式花粉采集器，利用氣室產(chǎn)生一定速度的氣流撞擊載玻片，花粉就被粘合劑黏住(楊穎，2007)。然后在室內應用生物光學顯微鏡或熒光顯微鏡對載玻片捕獲的轉基因花粉進行分類識別并按“日”定量計算。

自然重力法優(yōu)點是以自然沉降為基礎，沒有干擾花粉的自然分布規(guī)律，不足就在于花粉采集和數(shù)據(jù)讀取，需要大量人力。而動力通風采集法優(yōu)點是可以準確測量收集的氣體體積，但利用氣室產(chǎn)生氣流，人為改變作物花粉的局部自然條件，對研究花粉的自然分布規(guī)律有一定影響。并且這兩種方法均不能獲得建立轉基因花粉在自然環(huán)境中傳播定量安全評估模型所需的具有足夠時空分布精度的花粉按“時”實測資料。綜合上述兩種方法優(yōu)點，研制出一種既不干擾花粉的自然沉降，又能獲得高時空分辨率的轉基因花粉自動采集傳感器。該儀器能自動對花粉進行數(shù)字顯微成像并對采集的花粉進行分類處理，按“時”自動生成四維時空分布的轉基因花粉資料。作物花粉自動采集傳感器依照Durham提出的方法，通過單片機控制簡易機械臂操作采樣平臺上的載玻片(其上涂有凡士林作為粘合劑)置于轉基因作物自然生長環(huán)境中捕獲空氣中自由逃逸花粉，按設定時序，將采樣載玻片置于生物顯微鏡下，利用CMOS(complementary metal-oxide-semiconductor)視頻傳感器將生物顯微鏡生成的光學圖像轉換成數(shù)字圖像，經(jīng)嵌入式ARM(advanced RISC machines)單片機計算處理并存儲。2009年9月11—24日，在江蘇省農(nóng)科院溧水植物種植基地，該儀器用于轉基因玉米和轉基因水稻的花粉采集，取得大量玉米花粉及水稻花粉的實測資料。在距離花粉源相同距離、相同高度處，同一天(時)采集數(shù)據(jù)對比。自然重力法測得的玉米平均花粉密度為46.83粒/(cm2·h)、水稻平均花粉密度132.88粒/(cm2·h);儀器測得玉米平均花粉密度為31.2粒/(cm2·h)、水稻平均花粉密度189.32粒/(cm2·h)，儀器所獲資料與傳統(tǒng)人工觀測值基本一致。圖1是采集逃逸花粉圖像。

圖1 傳感器采集的水稻花粉圖像Fig.1 Image of rice pollen captured by the sensor

1.2 硬件組成及主要功能

該傳感器由數(shù)控簡易機械臂、單目生物顯微鏡、CMOS視頻傳感器、嵌入式ARM微處理器、風向標控制的轉動平臺、電源等單元組成(圖2)。

圖2 硬件結構示意圖Fig.2 Schematic diagram of the hardware

1)數(shù)控簡易機械臂:由可編程控制器、驅動器、3個步進電機及傳動機構組成。通過3個步進電機實現(xiàn)采樣平臺的自由移動。0#電機控制顯微鏡在調焦時的上下移動;1#電機控制載玻片的左右移動;2#電機控制載玻片的前后移動。組合起來就可以實現(xiàn)顯微鏡對載玻片的調焦與拍攝時的視野控制。電機控制的最小移動步距是微米量級，可實現(xiàn)準確的對焦和移動。2)單目生物顯微鏡:由傳統(tǒng)生物顯微鏡進行改裝而成。與傳統(tǒng)顯微鏡不同的是將顯微鏡的目鏡部分換成CMOS視頻傳感器，將物鏡看到的內容顯示在CMOS傳感器上，然后將CMOS生成的圖像信號傳輸?shù)紸RM控制數(shù)據(jù)采集器。3)CMOS視頻傳感器:通過CMOS成像技術將顯微鏡下的光學圖像轉換成數(shù)字圖像，便于后期的資料采集和處理。4)嵌入式ARM微處理器:利用ARM單片機控制CMOS視頻傳感器拍照，采集花粉圖片并暫時儲存數(shù)據(jù)資料。5)存儲設備SD卡:存儲ARM中FLASH的數(shù)據(jù)，利于后期資料存儲、處理和分析。6)電源:24 V便攜式鋰電池，使儀器能長期野外運行，不用外接電源。整個儀器置于防風避光的密封罩內，并固定在能自由轉動的平臺上，通過附帶的風向標可使儀器隨風向的變化而自動調整方向?？刂破髯詣硬僮骱喴讬C械臂按設定的時間順序，將載玻片從密封罩的窗口置于作物生長的田野中采集花粉，或將退回罩內置于顯微鏡下經(jīng)過自動對焦進行攝像。轉動平臺固定在高度可調的三腳架上。

2 儀器定標

不同作物花粉外形結構不同，從不同角度觀察可呈圓形、橢圓形、菱形等不同形狀，且當花粉粘連重疊時花粉形狀更為復雜，不易區(qū)分識別。而且單粒花粉尺度在數(shù)十微米，自動識別不同的花粉類型，定量估算單位面積上的花粉密度，必須對數(shù)字顯微圖像的光學放大率、幾何失真進行定標估計，同時還需對載玻片的顯微拍攝抽樣率進行定量估計，即對載玻片進行多少次顯微抽樣拍攝可獲得代表性的單位面積花粉密度。

2.1 儀器的安置

圖3中間是花粉自動采集傳感器，傳感器正對玉米試驗田采集玉米花粉(下風方向)。儀器兩側支架放置載玻片采集花粉，與傳感器采集數(shù)據(jù)進行比對。

圖3 作物花粉自動采集傳感器Fig.3 Crop pollen auto-acquisition sensor

2.2 幾何尺度定標

由數(shù)字相機拍攝的圖片是對應物鏡下視場經(jīng)生物顯微鏡放大以及CMOS轉換成像，為計算顯微視場真實幾何面積S(單位:mm2)及花粉尺度和形狀，需對圖片光學放大倍數(shù)F(無單位標量)進行幾何定標并對成像過程中產(chǎn)生的幾何失真進行評估。用標準醫(yī)用血球計數(shù)板XB-K-25(圖4)進行拍攝定標。血球計數(shù)板是由一塊比普通載玻片厚的特制玻片制成，玻片中有4條下凹的槽，構成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，其上均有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)上刻有9個大方格(圖5)，中間的一個大方格A作為定標室。定標室長和寬各為1 mm，深度為0.1 mm，其容積為0.1 mm3。定標室又分成25個中格，中格又進一步的分成16個小格，這樣一個定標室共分400個小格，每小格面積是1/400 mm2，小格的行間距Δx(單位:mm)為1/20 mm，即Δx=0.05 mm。

圖4 血球計數(shù)板俯視圖Fig.4 Planform of blood cell count plate

圖5 方格網(wǎng)放大圖Fig.5 Grid Enlargement Figure

定標時，將血球計數(shù)板水平放置于儀器載物平臺上，調節(jié)平臺控制系統(tǒng)，使血球計數(shù)板定標室A置于顯微物鏡視場中央，并在CMOS傳感器上呈現(xiàn)清晰的網(wǎng)格圖像(圖6)，圖6中黑點是鏡頭附著的灰塵。

圖6 定標網(wǎng)格圖Fig.6 Calibration grid figure

在調節(jié)過程中，要求視野中的網(wǎng)格線與圖像邊緣基本平行，拍攝時控制兩者誤差在一個像素，即控制圖6中同一水平線兩點i、j縱坐標之差小于1，通過換算圖中一個像素放大前的真實尺寸為0.001 mm。后將拍攝成像的定標網(wǎng)格圖保存到存儲設備。通過測量定標網(wǎng)格圖6中c、e兩點坐標(x1，y1)、(x2，y1)，計算標準小方格放大后間距D(單位:mm)，進而可得系統(tǒng)的光學放大倍數(shù)F，即F=D/Δx。從整個評估分析測量過程中發(fā)現(xiàn)，采樣點位置、采樣點小方格邊界清晰度、人為測量誤差等影響測量結果，為提高評估精度，減少讀數(shù)誤差，通過數(shù)控簡易機械臂微調血球計數(shù)板位置，重新拍攝存儲，如此循環(huán)完成8組相互獨立定標圖像的采集，每張定標網(wǎng)格圖讀取20個小方格，如圖7所示圓點所示小方格，讀數(shù)點整體分布是從圖片中心向外輻射的形狀，且讀數(shù)點均勻分布。對每幅圖讀取的20個數(shù)據(jù)去掉極端值，求出平均ˉD(單位:mm)，并計算F(圖8)，圖8中標準小方格放大間距ˉD分布在16.300～16.500 mm之間，相應的光學放大倍數(shù)F為326～330，取F=328作為定標值。

圖7 采樣點分布示意圖Fig.7 Distribution of sampling points

用于讀取樣本資料的顯微鏡視場實際面積S是CMOS成像圖片面積與系統(tǒng)線性放大倍數(shù)F2之比，即S=lh/F2。式中l(wèi)、h分別為圖片長和寬，l=45.16 cm、h=36.12 cm。那么視場真實面積S=1.516 mm2。

光學系統(tǒng)幾何失真分布不均，即光學放大倍數(shù)F隨距圖片中心距離R(單位:mm)改變而變化，因此在成像圖片的不同位置，估算同一花粉的尺度結果不同。在R相等的距離圈處，光學放大倍數(shù)F均值相等，所以取45°最長軸研究光學放大倍數(shù)F變化。以定標圖片中心為原點，水平方向為X軸，垂直方向為Y軸建立直角坐標系。在前面讀數(shù)的基礎上，于45°方位對角線上添加等距的4個測量點，如圖7中“+”所示。將45°對角線上測得的標準小方格放大間距D(單位:mm)，按距離中心原點的距離R見圖9。

圖8 小網(wǎng)格間距ˉD(a;單位:mm)與光學放大倍數(shù)F(b)Fig.8 (a)Small grid spacingˉD(units:mm)and(b)optical magnification F

隨離原點距離R的增大，標準小方格放大后在圖像上呈現(xiàn)的間距D在逐漸減小，距離R越大，D減小的幅度也越大，D的擬合曲線方程為

相應的光學放大倍數(shù)F=D/Δx的擬合曲線為

F的變化規(guī)律與系統(tǒng)的幾何光學特性有關，在放大成像過程中，圖像邊緣的幾何失真大于中心的幾何失真。

圖10中玉米花粉粒B距離圖片中心距離R=75.44 mm，其面積Q=5.25 cm2，相對的FR=328.56，

圖9 45°方向上小方格間距D隨距離R的變化Fig.9 Variation of small square spacing D with R on the 45°direction

那么其真實面積QR=0.004 86 mm2。在圖片中心處F'=330.68，若將目標花粉B置于中心的真實面積Q'=0.004 8 mm2，若將目標花粉B置于圖像的左下角，則對應的面積為0.005 46 mm2，兩者訂正真實面積之差ΔQ=0.000 66mm2，是中心訂正真實面積Q'的13.75%。這一誤差對利用資料計算花粉密度，累積花粉個數(shù)無影響。但當計算花粉幾何尺度必須對原始資料進行幾何訂正，否則結果誤差較大。

2.3 載玻片拍攝抽樣定標

載玻片拍攝抽樣定標指確定儀器使用時，對每張載玻片抽樣拍攝多少張圖片可獲得準確的單位面積花粉密度。抽樣數(shù)目N(單位:張)的確定主要受兩個因素影響，一是精度，精度越高，效果越好;二是儀器效率，在精度一定的情況下，還要求儀器有更高的拍攝效率。

眾所周知，總體樣本數(shù)一樣時，抽樣的數(shù)目越多，抽樣精度就越高。利用外場實驗采集的水稻和玉米花粉資料，計算一張載玻片上不同拍攝抽樣數(shù)的單位面積花粉密度。對不同拍攝抽樣數(shù)時的花粉密度與最大抽樣(樣本數(shù)目最多)時的花粉密度進行相關性分析(圖11)。

圖10 玉米花粉圖Fig.1 0Maize pollen picture

圖11 水稻花粉和玉米花粉抽樣相關系數(shù)Fig.1 1Sampling correlation coefficient of rice pollen and maize pollen

如圖11所示，玉米花粉和水稻花粉抽樣相關系數(shù)隨拍攝抽樣數(shù)的增加增大。說明在總體樣本數(shù)一樣的情況下，拍攝抽樣的數(shù)目越多，那么抽樣精度就越高。但是拍攝抽樣數(shù)目越大，拍攝圖片的時間就會越長，使得儀器效率下降。由圖11可見在使用本儀器采集基因花粉時，當抽樣數(shù)目N大于50，相關系數(shù)大于95%。

另從圖11還可以看出，當取前40個拍攝抽樣時，相應的玉米花粉密度的相關系數(shù)較水稻的小很多，主要是因為兩者單位面積花粉密度不同。圖12給出了不同花粉密度對抽樣結果的影響，可見，在不同拍攝抽樣數(shù)時，玉米花粉和水稻花粉的花粉密度與最大抽樣(樣本數(shù)目最多)時花粉密度的相對誤差曲線。

圖12 水稻玉米在不同濃度下的相對誤差Fig.1 2Rice and maize pollen relative error at different densities

在采集基因花粉過程中，其他硬件條件不變，影響結果主要因素是花粉濃度。從圖12中所示，水稻花粉密度大，均值在180粒/cm2以上，其對應的相同面積抽樣相對誤差在30%以下，并且隨著拍攝抽樣數(shù)增大而減小，但是其變化幅度不大。而玉米組，其單位面積花粉密度很小，而相同面積上抽樣的相對誤差的變化范圍大。當取前20視場觀測數(shù)據(jù)時，其相對誤差達到44%以上。后隨拍攝抽樣數(shù)的增大，相對誤差逐漸減小。當拍攝抽樣數(shù)為50張時，相對誤差降到28%。所以拍攝抽樣數(shù)在作物基因花粉濃度較小時，對抽樣精度的影響大于作物基因花粉濃度較大的時候。因此在要求抽樣精度一定時，花粉濃度大時，可適當減少其抽樣數(shù)目。

3 總結

研制的作物花粉自動采集傳感器通過ARM控制簡易機械臂操作采樣平臺上的載玻片，將其置于作物自然生長的環(huán)境中捕獲空氣中自由擴散的花粉粒子，按設定的時序，將采樣載玻片置于生物顯微鏡下，用CMOS視頻傳感器將生物顯微鏡生成的光學圖像轉換成數(shù)字圖像，經(jīng)嵌入式ARM單片機計算處理并存儲。

利用外場實測資料和標準醫(yī)用血球計數(shù)板，對儀器進行幾何尺度標定及載玻片拍攝抽樣定標。儀器光學放大倍數(shù)F定為328，視場真實面積S為1.516 mm2，當拍攝抽樣數(shù)N為50次時，相關系數(shù)大于95%。

由于幾何失真系統(tǒng)光學放大倍數(shù)F，呈現(xiàn)從圖片中心向四周擴散的拋物線形變化規(guī)律，即F=－0.000 42R2+0.003 6R+330.68，其中R是圖片中任意一點距離圖片中心的距離。實測取樣面積誤差最大可達13.75%。這一誤差對利用資料計算花粉密度，累積花粉個數(shù)無影響。但當計算花粉幾何尺度必須對原始資料進行幾何訂正，否則結果誤差較大。

最后分析花粉濃度對拍攝抽樣定標影響，當抽樣精度一定，花粉濃度大時，可適當減少抽樣數(shù)目。水稻單位面積花粉密度大于玉米單位面積花粉密度，要求抽樣精度為90%時，水稻花粉需要拍攝抽樣40次，而玉米花粉則需要拍攝抽樣80次。

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