楊金招，范建萍，王友群

(中國藥科大學(xué)藥理研究室，江蘇南京 210009)

附子及附子配伍干姜對腺嘌呤所致慢性腎衰小鼠腎功能的影響

楊金招，范建萍，王友群*

(中國藥科大學(xué)藥理研究室，江蘇南京 210009)

目的:研究中藥附子及附子配伍干姜對腺嘌呤所致小鼠慢性腎衰的療效，并初步探討其作用機(jī)制。方法:將雄性ICR小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、低劑量附子組、高劑量附子組、低劑量附子+干姜組和高劑量附子+干姜組。正常對照組小鼠灌胃給予蒸餾水;其余各組小鼠灌胃給予腺嘌呤(第1周和第2～4周的給藥劑量分別為250和130 mg·kg－1，均為每2天給藥1次)，低劑量附子組、高劑量附子組、低劑量附子+干姜組和高劑量附子+干姜組小鼠另分別灌胃給予相應(yīng)的水煎液，每天1次。實驗過程中，記錄各組小鼠的一般情況，并于實驗結(jié)束時，對小鼠血清肌酐、尿素氮、乳酸和乳酸脫氫酶，以及腎組織谷胱甘肽、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和丙二醛的含量進(jìn)行測定，并記錄附睪精子數(shù)。結(jié)果:與正常對照組相比，模型組和各給藥組小鼠體重下降，攝食量減少，飲水量升高;高劑量附子組和低劑量附子+干姜組小鼠飲水量明顯低于模型組小鼠。模型組小鼠消瘦、萎靡、被毛發(fā)黃干枯不齊，部分死亡;高劑量附子+干姜組和低劑量附子+干姜組小鼠被毛白凈有光澤，且活動性更強(qiáng)。高劑量附子水煎液，高劑量附子+干姜水煎液，以及低劑量附子+干姜水煎液對小鼠生化指標(biāo)具有顯著改善作用，可降低腎系數(shù)以及血清肌酐、尿素氮、乳酸和乳酸脫氫酶水平，提高精子數(shù);可降低小鼠腎組織GSH水平，升高M(jìn)DA水平;高劑量附子組和高劑量附子+干姜組小鼠腎組織ALT水平，以及高劑量附子+干姜組和低劑量附子+干姜組小鼠腎組織AST水平均顯著高于模型組;低劑量附子組小鼠除個別指標(biāo)外，無明顯的改善。結(jié)論:高劑量附子水煎液對腺嘌呤所致慢性腎功能衰竭小鼠腎功能具有一定保護(hù)作用，與干姜配伍后其療效增加，毒性降低。

腺嘌呤;慢性腎功能衰竭;附子;干姜

腺嘌呤是用于誘發(fā)慢性腎功能衰竭(CRF)動物模型的常用藥物，其造成的CRF從中醫(yī)的角度上來看，屬于腎陽虛［1－2］，該模型的許多癥狀與人類腎陽虛型CRF的臨床表現(xiàn)也十分相似。研究顯示，腺嘌呤代謝產(chǎn)物可通過阻塞腎小管而引起腎功能衰竭;也有學(xué)者認(rèn)為腺嘌呤代謝產(chǎn)物具有一定毒性，可使腎組織中與糖、蛋白質(zhì)和脂肪代謝有關(guān)的多種酶活性受到抑制，進(jìn)而影響腎組織的能量代謝，這可能是腺嘌呤引起腎陽虛癥候的機(jī)制之一［1，3－4］。附子為毛茛科植物烏頭的子根，性味辛、甘，性大熱，有毒，歸心、腎經(jīng)，有回陽救逆、補(bǔ)火助陽及散寒止痛之功效，主治陽虛陰盛之證，中醫(yī)臨床一般通過長時間煎煮和配伍用藥降低其毒性;干姜為姜科植物姜的干燥根莖，性辛溫，無毒，具有溫中散寒、回陽通脈及燥濕消痰等功效。筆者通過腺嘌呤誘導(dǎo)的小鼠CRF模型，考察附子對小鼠腎功能的保護(hù)作用，以及配伍干姜是否能減小附子毒性并增強(qiáng)其療效，并初步探討附子的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥品與試劑

腺嘌呤(批號為9905078，上海博蘊(yùn)東風(fēng)生物科技有限公司);川附子(批號為20100726，購自南京市益豐大藥房，經(jīng)中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院王強(qiáng)教授鑒定為川附子);考馬斯亮蘭(批號:20101025)、肌酐(Cr)檢測試劑盒(批號:20101025)、尿素氮(BUN)檢測試劑盒(批號:20101025)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測試劑盒(批號:20101026)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測試劑盒(批號:20101026)、乳酸(LD)檢測試劑盒(批號: 20101026)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(批號: 20101026)、谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒(批號: 20101026)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒(批號: 20101026)等均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物

雄性ICR小鼠143只，體重(25±2)g，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖廠，動物合格證號: SCXK(蘇)2007－0001。

1.3 儀器

721 型分光光度計(上海第三分析儀器廠); 0412－1型低速離心機(jī)［上海醫(yī)療器械(集團(tuán))有限公司］;BS－110－S型電子天平(北京賽多利斯公司)。

2 方法

2.1 水煎液的制備

取附子100 g，加入水1 000 mL，大火煮沸后改為小火微沸60分鐘，用脫脂棉過濾，濾渣再加水800 mL以相同方法煮沸、過濾，合并兩次濾液，小火濃縮至200 mL，即得每毫升相當(dāng)于0.5 g附子(低劑量附子)的水煎液;取附子200 g，以相同方法得到每毫升相當(dāng)于1 g附子(高劑量附子)的水煎液;取附子和干姜各100 g，以相同方法得到每毫升相當(dāng)于0.5 g附子和0.5 g干姜(低劑量附子+干姜)的水煎液;取附子200 g，干姜100 g，以相同方法得到每毫升相當(dāng)于1 g附子和0.5 g干姜(高劑量附子+干姜)的水煎液。

2.2 動物分組及給藥方案

雄性ICR小鼠隨機(jī)分為6組:對照組(C組，n= 12)、模型組(M組，n=31)、低劑量附子組(FL組，n=25)、高劑量附子組(FH組，n=25)、低劑量附子+干姜組(FLG組，n=25)和高劑量附子+干姜組(FHG組，n=25)。按照Yokozawa等［5－6］報道的實驗方法，分別給對照組小鼠和另外5組小鼠灌胃使用蒸餾水和腺嘌呤水溶液(第1周和第2～4周的給藥劑量分別為250和130 mg·kg－1，均為每2天給藥1次，上午給藥)。FL組、FH組、FLG組和FHG組小鼠在接受腺嘌呤的基礎(chǔ)上，每天下午再對其灌胃給予“2.1”項下制備的低、高劑量附子水煎液、低劑量附子+干姜水煎液以及高劑量附子+干姜水煎液(10 mL·kg－1·d－1)，對照組小鼠給予蒸餾水(10 mL·kg－1·d－1，共4周)。

2.3 考察指標(biāo)

2.3.1 動物一般情況觀察給藥期間小鼠的身體狀況和活動情況，每2天記錄1次體重、攝食量及飲水量。

2.3.2 生化指標(biāo)于實驗結(jié)束時，摘除小鼠眼球，取其全身血液致死，血樣在2 000 r·min－1轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，然后取上層血清測定其中Cr、BUN、LD及LDH等指標(biāo)的含量;解剖小鼠并分離其附睪，剪碎并分散于6 mL 37℃生理鹽水中，孵育0.5小時后，在顯微鏡下觀察并記錄附睪精子數(shù);取右側(cè)腎臟和睪丸，計算腎臟系數(shù)(單側(cè)腎臟質(zhì)量/小鼠體重)和睪丸系數(shù)(單側(cè)睪丸質(zhì)量/小鼠體重);取左側(cè)腎臟組織，按質(zhì)量體積比1∶9加入生理鹽水，在冰浴條件下制成組織勻漿，在3 000 r·min－1轉(zhuǎn)速下離心10分鐘后取上清液，測定其中GSH、ALT、AST和MDA等指標(biāo)的含量;組織蛋白濃度采用考馬斯亮蘭法測定，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，采用t檢驗方法對組間差異進(jìn)行顯著性分析。

3 結(jié)果

3.1 動物一般情況

與正常對照組相比，接受腺嘌呤灌胃給藥的各組小鼠體重下降，攝食量減少，各給藥組與模型組小鼠體重及攝食變化均無顯著性差異(見圖1和圖2)。接受腺嘌呤灌胃給藥的各組小鼠的飲水量均高于正常對照組;與模型組小鼠相比，F(xiàn)H組和FLG組小鼠飲水量明顯下降(見圖3)。

圖1實驗期間各組小鼠體重變化Figure 1 Changes in body weights of the mice in different groups during the period of the experiment

圖2實驗期間各組小鼠攝食量變化Figure 2 Changes in food intake of themice in different groups during the period of the experiment

圖3實驗期間各組小鼠飲水量變化Figure 3 Changes in water intake of the mice in different groups during the period of the experiment

模型組小鼠消瘦、萎靡、被毛發(fā)黃干枯不齊，部分小鼠死亡;與模型組相比，F(xiàn)L組和FH組動物狀態(tài)未見明顯改善，而FLG組和FHG組小鼠被毛白凈，且活動性更強(qiáng)，但這4組均有部分小鼠出現(xiàn)死亡。本研究結(jié)束時，正常對照組、模型組、FL組、FH組、FLG組和FHG組小鼠死亡率分別為0%(0/ 12)、45.2%(14/31)、20%(5/25)、44%(11/25)、28%(7/25)和36%(9/25)。

3.2 附子及附子配伍干姜水煎液對小鼠腎臟系數(shù)、睪丸系數(shù)的影響

與正常對照組小鼠相比，模型組小鼠腎臟系數(shù)顯著升高(P＜0.001)，睪丸系數(shù)無顯著性差異，精子數(shù)量顯著降低(P＜0.01)。與模型組小鼠相比，F(xiàn)H組、FLG組和FHG組小鼠腎臟系數(shù)顯著降低，F(xiàn)L組、FLG組和FHG組小鼠精子數(shù)顯著增加，提示單用附子對腎臟和生殖功能有一定保護(hù)作用，與干姜配伍后則顯示出更顯著的療效(見表1)。

表1各組小鼠腎系數(shù)、睪丸系數(shù)和精子數(shù)(ˉx±s，n=8)Table 1 Changes in kidney index，testis index and sperm counts of mice in different groups

3.3 附子及附子配伍干姜水煎液對小鼠血液生化指標(biāo)的影響

血液生化指標(biāo)測定結(jié)果顯示，模型組小鼠血清Cr、BUN、LD和LDH水平均顯著低于正常對照組; FH組、FLG組和FHG組小鼠的血清Cr和BUN水平均顯著低于模型組，而FL組與模型組無顯著差異。FL組、FH組、FLG組和FHG組小鼠血清LD和LDH均顯著低于模型組，且FL組、FLG組和FHG組小鼠的血清LDH與正常對照組無顯著性差異。

表2各組小鼠血清肌酐、尿素氮、乳酸和乳酸脫氫酶水平測定結(jié)果(ˉx±s，n=8)Table 2 Results of the content determination for serum Cr，BUN，LD and LDH ofmice in different groups

3.4 附子及附子配伍干姜水煎液對小鼠腎組織生化指標(biāo)的影響

腎組織生化指標(biāo)測定結(jié)果顯示，模型組小鼠腎組織中的GSH水平顯著高于正常對照組，而蛋白、MDA、ALT和AST水平顯著低于正常對照組。FH組和FLG組小鼠腎組織中GSH水平顯著低于模型組，且FLG組小鼠腎組織中GSH水平與正常對照組無顯著性差異;FH組、FLG組和FHG組小鼠的腎組織中蛋白和MDA水平顯著高于模型組，且FH組小鼠腎組織中的MDA水平與正常對照組無顯著性差異;模型組小鼠腎組織中ALT和AST水平均顯著低于正常對照組，而FH組和FHG組小鼠腎組織中的ALT水平，以及FLG組和FHG組小鼠腎組織中的AST水平均顯著高于模型組(見表3)。

表3腎組織蛋白、谷胱甘肽、丙二醛、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平測定結(jié)果(ˉx±s，n=8)Table 3 Results of the content determination for protein，GSH，MDA，ALT and AST in kidney ofmice in different groups

4 討論

在本實驗中，F(xiàn)L組小鼠死亡率低于模型組，但結(jié)合其生化指標(biāo)可知，低劑量附子水煎液治療作用并不明顯;FH組小鼠生化指標(biāo)與模型組具有顯著性差異，然而死亡率與模型組相近，提示高劑量附子水煎液有較大毒性;FLG組和FHG組小鼠死亡率明顯低于模型組，提示附子與干姜配伍后其毒性下降。

本研究結(jié)束時，模型組小鼠的血清Cr和BUN水平分別約為對照組小鼠的3倍和5倍;模型組小鼠腎臟腫大、蒼白，表面不光滑，質(zhì)地堅硬。FH組、FLG組及FHG組小鼠血清Cr和BUN水平均顯著低于模型組，表明高劑量附子水煎液、低劑量附子干姜水煎液和高劑量附子干姜水煎液對小鼠腎功能具有一定改善作用;FL組小鼠的血清Cr和BUN水平未見改善。此外，模型組小鼠腎臟腫大，而腎臟蛋白水平卻顯著低于對照組，故筆者認(rèn)為腺嘌呤誘導(dǎo)的腎臟病變屬于水腫，而非增生。高劑量附子水煎液和低、高劑量附子+干姜水煎液均能顯著降低小鼠腎系數(shù)，提示附子可能通過促進(jìn)毒素排泄緩解腎臟水腫，從而降低腎系數(shù)。

研究顯示，正常情況下，人體20%LD可經(jīng)腎臟清除，當(dāng)腎功能受損時，LD的清除勢必受到影響，血清LD水平升高，最終引起酸中毒［7－8］。本研究中，模型組小鼠血清LD和LDH水平均顯著高于正常對照組小鼠，F(xiàn)H組和FL組小鼠LD水平均低于模型組，但仍高于對照組，表明附子可通過改善腎功能促進(jìn)LD的清除，但作用有限;當(dāng)與干姜配伍后，附子的降LD作用加強(qiáng)，F(xiàn)LG組小鼠LD水平最接近于對照組。

轉(zhuǎn)氨酶是催化氨基酸與酮酸之間氨基轉(zhuǎn)移的一類酶，廣泛存在于動物心肌、腦、肝和腎等組織中，其中以ALT和AST最為重要。ALT可催化谷氨酸與丙酮酸之間的轉(zhuǎn)氨基作用，AST可催化谷氨酸與草酰乙酸之間的轉(zhuǎn)氨基作用。本研究中的腎衰模型小鼠腎組織蛋白、ALT和AST水平均顯著低于對照組;FH組、FLG組和FHG組小鼠腎組織蛋白濃度，F(xiàn)H、FHG組小鼠腎組織ALT水平，以及FLG組、FHG組小鼠腎組織AST水平，均顯著高于模型組小鼠的上述相應(yīng)指標(biāo)，可見高劑量附子+干姜水煎液可通過調(diào)節(jié)ALT和AST活性促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)合成。Ikegwuonu等［9］曾發(fā)現(xiàn)，給大鼠腹腔注射黃曲霉素B后，大鼠腎組織AST水平降低，故而其催化生成的天冬氨酸減少，由此導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成減少，該結(jié)果與本研究中模型組小鼠腎蛋白及轉(zhuǎn)氨酶水平均顯著低于對照組的實驗結(jié)果一致;然而也有文獻(xiàn)報道，將大鼠暴露在強(qiáng)度為108 dB(A)的噪聲下，其體內(nèi)胰島素分泌減少，細(xì)胞和支持細(xì)胞的耗氧量增加，使肌肉蛋白質(zhì)分解加強(qiáng)，大量氨基酸釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)ALT活性升高［10］，與本研究結(jié)果相悖。因此，關(guān)于腺嘌呤和附子配伍干姜影響腎組織ALT和AST水平的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，可用于反映細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)。本研究顯示，模型組小鼠腎臟MDA水平顯著低于對照組，而GSH含量顯著高于對照組，提示模型組小鼠腎臟中與氧化還原相關(guān)的酶處于低活性狀態(tài)，這可能是腺嘌呤引起腎陽虛癥候的機(jī)制之一。FH組、FLG組及FHG組小鼠的腎臟MDA水平均顯著高于模型組，F(xiàn)H組和FLG組小鼠腎臟GSH水平低于模型組，提示附子可能通過改善腎臟的能量供應(yīng)，促進(jìn)GSH的利用［11］。

本研究通過探索附子配伍干姜對腺嘌呤所致的CRF小鼠的腎功能的改善作用，為附子干姜這一藥對的療效，以及干姜對附子的減毒增效作用提供了佐證，但其具體機(jī)制需深入探索。

［1］鄭平東，朱燕俐，丁名城，等.腺嘌呤誘發(fā)“腎陽虛”動物模型的研制［J］.中國醫(yī)藥學(xué)報，1990，5(3):68－73.

［2］傅曉晴，武一曼，陳振彬，等.腺嘌呤制作腎陽虛型慢性腎功能衰竭大鼠模型的電鏡病理學(xué)研究［J］.福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2002，12(3):41－43.

［3］杜卉蓮.腺嘌呤制備陽虛型慢性腎功能衰竭大鼠模型綜合指標(biāo)及其機(jī)理研究［D］.福州:福建中醫(yī)學(xué)院，2006.

［4］孫景波，華榮，曾星，等.用以藥測證原理研究慢性腎衰大鼠模型的中醫(yī)證候?qū)傩裕跩］.現(xiàn)代中醫(yī)藥，2004 (2):61－63.

［5］Yokozawa T，Zheng P D，Oura H，et al.Animalmodel of adenine－induced chronic renal failure in rats［J］.Nephron，1986，44(3):230－234.

［6］孫淑玲，李斌，任穎佳等.小鼠慢性腎功能衰竭動物模型的中藥干預(yù)和病理觀察［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2002，12(4):221－222.

［7］段慧.腎功能衰竭患者乳酸變化的研究［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2006，22(18):2760－2761.

［8］De Backer D.Lactic acidosis［J］.Intens Care Med，2003，29(5):699－702.

［9］Ikegwuonu F I，Egbunike G N，Emerole G O，et al.The effects of aflatoxin B1 on some testicular and kidney enzyme activity in rat［J］.Toxicology，1980，17(1):9－16.

［10］羅一丁，楊洪禹，龐桂倉.黃芪及其復(fù)方對噪聲影響大鼠肝糖原和肝GPT活性的防護(hù)［J］.解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2009，27(6):423－424.

［11］劉蘭蘭，王友群.附子對腺嘌呤造成的小鼠慢性腎衰的療效及其機(jī)制探討［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2010，6(6): 28－30.

The Effects of the Prepared Aconite Lateral Root and the Prepared Aconite Lateral Root Combined with Dried Ginger on Renal Function of Mice w ith Chronic Renal Failure Induced by Adenine

YANG Jin－zhao，F(xiàn)AN Jian－ping，WANG You－qun

(DepartmentofPharmacology，ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing210009，China)

Objective:To observe the therapeutic effects of the prepared aconite lateral root and the prepared aconite lateral root combined with dried ginger on chronic renal failure(CRF)inmice，and to explore the related mechanisms preliminarily.Methods:Male ICRmice were randomly divided into 6 groups including control group，model group，low dose group of prepared aconite lateral root(FL group)and high dose group(FH group)，as well as low dose group of prepared aconite lateral root combined with dried ginger(FLG group)and high dose group(FHG group).Themice in control group and the other groupswere given distilled water and adenine(250 mg?kg－1，every two days in the first week;130 mg?kg－1，every two days from the second week to the fourth week)by intragastric administration，respectively.Themice in FL group，F(xiàn)H group，F(xiàn)LG group and FHG group were given the corresponding water extracts by intragastric administration once daily.The general conditions of themicewere observed and the contents of creatine(Cr)，urea nitrogen(BUN)，lactic acid(LD)and lactate dehydrogenase(LDH)in blood serum were determined.The kidneys were homogenated for measuring glutathione(GSH)，alanine transaminase(ALT)，aspartate aminotransferase(AST)and malonaldehyde(MDA).Besides，the number of sperm in the left epididymis of mice was recorded.Results:Compared with control group，the body weight and food intake of mice in model group and test groups decreased significantly，with the drinking amount increased.The drinking amount of mice in FH group and FLG group was lower than that of model group.Themice in model group became emaciated，weary and clothing hair－kraurotic，and some died during the experimental period.The mice in FHG group and FLG group had tramosericeous clothing hair，and they were more active.Compared with model group，the biochemical indicators ofmice in FH group，F(xiàn)LG group and FHG group were improved significantly，with the blood Cr，BUN，LD and LDH reduced，and sperm count was raised.Compared withmodel group，the GSH and MDA levels in the nephridial tissue of mice were reduced and raised respectively in the above groups.Moreover，the ALT level of nephridial tissue in FH group and FHG group，as well as the AST level in FLG group and FHG group were higher than those of model group.The biochemical indicators in FL group were not improved，except for a few indexes.Conclusion:The water extract from prepared aconite lateral root of high dose can protect the renal function of mice with chronic renal failure induced by adenine.Dried ginger can enhance the effects of the prepared aconite lateral root，and reduce its toxicity.

adenine;chronic renal failure;prepared aconite lateral root;dried ginger

R 289.1;R 285.5

B

1001－5094(2011)05－0224－06

10.3969/j.issn.1001－5094.2011.05.005

［接受日期］2011－02－21

*通訊作者:王友群，副教授;

研究方向:心血管藥理;

E-mail:wyqfbox@163.com

(責(zé)任編輯:楊臻崢)

熱點藥物追蹤