孫敏卓,孟仟祥,房 嬛,徐 茵

(中國(guó)科學(xué)院油氣資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730000)

不同溶劑抽提冷杉脂溶性物質(zhì)的GC/MS分析

孫敏卓,孟仟祥,房 嬛,徐 茵

(中國(guó)科學(xué)院油氣資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730000)

為了研究不同溶劑超聲波抽提的冷杉脂溶性物質(zhì)中有機(jī)化學(xué)成分的異同,采用氯仿一元溶劑、V(氯仿)∶V(甲醇)=3∶1的混合二元溶劑以及V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(丙酮)=4 ∶1∶1的混合三元溶劑,超聲波抽提冷杉脂溶性物質(zhì)的化學(xué)成分,氣相色譜法分離,質(zhì)譜法鑒定其結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,3種不同溶劑所抽提的脂溶性物質(zhì)在提取率、化學(xué)成分及含量等方面存在較大的差異。用氯仿一元溶劑超聲波抽提的脂溶性物質(zhì)的提取率最高,化學(xué)成分比較全面,是冷杉脂溶性物質(zhì)抽提的理想溶劑。

冷杉;超聲波抽提;脂溶性物質(zhì);氣相色譜-質(zhì)譜法(GC/MS)

冷杉為松科冷杉屬植物,高大挺直的塔狀常綠喬木。冷杉的枝葉、嫩葉和樹(shù)皮中含有揮發(fā)油,可用來(lái)制備冷杉精油。冷杉樹(shù)皮中含有大量提煉物,其組成成分類(lèi)似于樹(shù)木嫩枝綠葉中的提煉物[1]。目前,對(duì)冷杉化學(xué)成分的研究多集中于其揮發(fā)油,研究方法多采用水蒸氣蒸餾法,一般可檢測(cè)到萜類(lèi)化合物[2-3]。而對(duì)冷杉中有機(jī)化合物的全貌分析及檢測(cè)則很少,尤其是對(duì)冷杉不同餾分中生物標(biāo)志化合物分布特征的研究未見(jiàn)報(bào)道。本工作擬采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC/M S)法對(duì)不同溶劑超聲波抽提的冷杉脂溶性物質(zhì)成分進(jìn)行比較分析,為這一藥用和商用資源的研究開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

6890N-GC/5973N-M SD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:美國(guó)安捷倫科技有限公司產(chǎn)品,配有電子轟擊電離源(EI)及美國(guó)N IST02L譜庫(kù)。

KQ-50DE型數(shù)控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品,溫度35℃,頻率90 Hz。

1.2 主要材料與試劑

冷杉:采自青藏高原,將摘下的新鮮冷杉樹(shù)枝放在深色透氣袋中,袋口微開(kāi),置于陰涼處自然陰干,保存,備用;氯仿、正己烷、二氯甲烷、甲醇、無(wú)水乙醚、三氟化硼、硅膠和氧化鋁(分析純);天津化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱:美國(guó)J&W HP-5石英毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm×0.25μm);升溫程序:起始溫度80℃,以4℃/min升至290℃,保持30 min;載氣(He)流速 1.1 m L/min;壓力2.4 kPa;進(jìn)樣量 1.0μL;分流比 10∶1。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源,電子能量70 eV,傳輸線(xiàn)溫度280℃,離子源溫度230℃,母離子m/z285,激活電壓1.5 V,質(zhì)量掃描范圍m/z35～600。

1.3.3 超聲波條件 溫度40℃,頻率70 Hz。

1.4 樣品處理

稱(chēng)取1.012 6 g、1.015 7 g和1.019 6 g粉碎后的冷杉樣品,分別加入50 mL氯仿一元溶劑,50 m LV(氯仿)∶V(甲醇)=3∶1二元混合溶劑,以及 50 m LV(氯仿)∶V(甲醇)∶V(丙酮)=4∶1∶1三元混合溶劑,于40 ℃、70 Hz條件下超聲波抽提15 min,過(guò)濾,濾渣重復(fù)上述步驟。超聲波抽提3次,合并3次濾液,回收溶劑,至恒重時(shí)稱(chēng)重,分別為0.395 7 g、0.373 7 g和0.358 3 g。然后分別取0.100 0 g 3種脂溶性物質(zhì),經(jīng)V(硅膠)∶V(氧化鋁)=3∶1柱色層,分別以150 mL正己烷、100 mL二氯甲烷和100 m L甲醇作洗脫劑做族組成分離,分別得到冷杉一元、二元、三元溶劑抽提物的非極性餾分、弱極性餾分和極性餾分。最后,非極性餾分和弱極性餾分直接做 GC/M S分析,而極性餾分經(jīng)V(BF3)∶V(CH3OH)=1∶4的混合溶液甲酯化24 h,再經(jīng)乙醚萃取,進(jìn)行 GC/M S分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 抽提率

按1.4項(xiàng)處理冷杉樣品,所得提取率分別為39.08%、36.79%和35.14%,示于圖1。由此可知,一元溶劑的收率最大。

圖1 收率柱狀圖Fig.1 The histogram of yields

2.2 柱色層族組成特征

經(jīng)一元、二元、三元溶劑分別超聲波抽提得到的3種冷杉脂溶性物質(zhì),再經(jīng)不同溶劑柱色層洗脫得到非極性餾分、弱極性餾分、極性餾分,列于表1。

表1 冷杉不同溶劑抽提物柱色層族組成Table 1 The column chromatography composition of the extraction of different solvent of Fir

從表1可以看出,3種溶劑超聲波抽提所得的脂溶性物質(zhì)中主要為極性餾分,占脂溶性物質(zhì)的95%以上,非極性餾分和弱極性餾分僅占脂溶性物質(zhì)的4%左右。同時(shí)可以看出,一元溶劑抽提物的脂溶性物質(zhì)中,非極性餾分和弱極性餾分明顯高于二元抽提物中對(duì)應(yīng)的餾分;二元溶劑抽提物的脂溶性物質(zhì)中非極性餾分和弱極性餾分大于三元抽提物中對(duì)應(yīng)的餾分。

2.3 各餾分的化合物特征

2.3.1 非極性餾分 一元、二元、三元溶劑超聲波抽提冷杉樣品所得脂溶性物質(zhì)的非極性餾分中各系列化合物的相對(duì)百分含量列于表2。從3種不同溶劑抽提脂溶性物質(zhì)的非極性餾分中檢測(cè)出正構(gòu)烷烴和類(lèi)異戊二烯烷烴系列,以及松香烷衍生物系列,共22種有機(jī)化合物,列于表3。冷杉脂溶性物質(zhì)的非極性餾分以nC21和nC23正構(gòu)烷烴的相對(duì)豐度最高為特征,它們的最低相對(duì)百分含量為66.719%,最高為86.127%,正構(gòu)烷烴碳數(shù)分布為nC16～nC31。

表2 冷杉非極性餾分?jǐn)?shù)據(jù)表Table2 The data of the non-polar fraction of Fir

表3 冷杉非極性餾分鑒定表Table3 The identif ication table of the non-polar fraction of Fir

Pr/Ph為氧化還原常數(shù),可判斷原生質(zhì)在降解過(guò)程中環(huán)境的氧化還原條件。3種溶劑抽提所得的冷杉Pr/Ph值非常接近,約為0.345。由此表明,在冷杉離株之后的降解過(guò)程中,氧化還原環(huán)境大致相同。

OEP值為判識(shí)烷烴奇偶碳優(yōu)勢(shì)的參數(shù),高等植物原生質(zhì)中正構(gòu)烷烴呈現(xiàn)絕對(duì)的奇碳優(yōu)勢(shì),偶數(shù)碳異常低,其OEP值較高[4]。植物離株后,若遇到較強(qiáng)烈的熱作用或細(xì)菌-酶作用,均可以使植物的奇偶優(yōu)勢(shì)發(fā)生變化,即奇數(shù)碳的相對(duì)豐度逐漸變高[5],其演化終點(diǎn)為沒(méi)有奇偶優(yōu)勢(shì),出現(xiàn)偶數(shù)碳優(yōu)勢(shì)[6]。所研究的冷杉OEP值約為10.000,表明其呈現(xiàn)強(qiáng)烈的奇數(shù)碳優(yōu)勢(shì)特征,故說(shuō)明雖然冷杉離株之后經(jīng)一定的熱作用或細(xì)菌-酶作用,但仍保持植物原生質(zhì)的特點(diǎn)。

∑C22-/∑C23+值為高低碳數(shù)正構(gòu)烷烴比值。在高等植物原生質(zhì)中,正構(gòu)烷烴的分布表現(xiàn)為高碳數(shù)優(yōu)勢(shì),即 ∑C22-/∑C23+值遠(yuǎn)小于1。隨著高等植物離株之后的一系列降解過(guò)程,高碳數(shù)優(yōu)勢(shì)逐漸降低。所研究的冷杉 ∑C22-/∑C23+值為0.700～0.800,表明冷杉中的正構(gòu)烷烴系列曾經(jīng)歷過(guò)一定的降解過(guò)程,但降解過(guò)程不強(qiáng)烈。在降解作用下,其高碳數(shù)烷烴因去甲基和鏈斷裂效應(yīng)有向低碳數(shù)轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。

松香烷系列化合物是冷杉非極性餾分中十分重要的萜類(lèi)化合物,它來(lái)自植物的樹(shù)脂,而且該系列化合物在石油地質(zhì)樣品中常用作指示高等植物母質(zhì)的重要生物標(biāo)志。冷杉中的萜類(lèi)化合物具有一定的藥用價(jià)值,有治療感冒、風(fēng)濕和神經(jīng)痛等疾病的作用;冷杉針葉油單萜部分的化學(xué)組成可用于噴霧香精、香皂、牙膏、制藥及食品工業(yè)[7-8]。從表2可以看出,一元溶劑抽提物的非極性餾分中萜類(lèi)化合物的相對(duì)百分含量略高于二元抽提物中萜類(lèi)化合物,三元抽提物的非極性餾分中萜類(lèi)化合物的相對(duì)百分含量最低。由此說(shuō)明,一元溶劑抽提冷杉中的脂溶性物質(zhì)優(yōu)于二元和三元溶劑抽提。

2.3.2 弱極性餾分 從一元、二元、三元溶劑超聲波抽提冷杉樣品所得脂溶性物質(zhì)的弱極性餾分中檢測(cè)的有機(jī)化合物有較大的差別。

在一元溶劑超聲波抽提冷杉樣品所得脂溶性物質(zhì)的弱極性餾分中,檢測(cè)出一系列脂肪酸甲酯、氧化海松烯及一些大環(huán)化合物、甾族化合物等16種有機(jī)化合物,示于圖2a和表4。在二元溶劑超聲波抽提冷杉所得脂溶性物質(zhì)弱極性餾分中,檢測(cè)出氧化海松烯及少量脂肪酸甲酯、甾族化合物、芳烴化合物等9種有機(jī)化合物,示于圖2b。在三元溶劑超聲波抽提冷杉所得脂溶性物質(zhì)弱極性餾分中,僅檢測(cè)出氧化海松烯、脂肪酸甲酯等5種有機(jī)化合物,示于圖2c。

圖2 冷杉弱極性餾分的總離子流圖Fig.2 The total ion chromatograms of the weakly polar fraction of Fir

從圖2可以看出,在一元、二元、三元溶劑超聲波抽提冷杉樣品所得脂溶性物質(zhì)弱極性餾分中,檢測(cè)出的前6種化合物是一致的。在一元溶劑抽提物的弱極性餾分中,檢測(cè)到的有機(jī)化合物是相當(dāng)豐富的;而在二元、三元溶劑抽提物的弱極性餾分中,檢測(cè)到的有機(jī)化合物則相對(duì)匱乏?？梢?jiàn)對(duì)于弱極性餾分而言,一元溶劑的超聲波抽提要優(yōu)于二元和三元溶劑的超聲波抽提。

2.3.3 極性餾分 極性餾分是冷杉脂溶性物質(zhì)中最主要的餾分,占脂溶性物質(zhì)的95%以上。從一元、二元、三元溶劑超聲波抽提所得脂溶性物質(zhì)的極性餾分中主要檢測(cè)出直鏈脂肪酸系列化合物[9],且3種餾分檢測(cè)的結(jié)果相同,列于表5。直鏈脂肪酸碳數(shù)分布為nC14～nC30,呈雙駝峰型,前駝峰的主峰碳為nC16,后駝峰的主峰碳為nC22,示于圖3。

表4 冷杉弱極性餾分鑒定表Table 4 The identification table of the weakly polar fraction of Fir

表5 冷杉極性餾分鑒定表Table 5 The identification table of the polar fraction of Fir

圖3 冷杉極性餾分的總離子流圖Fig.3 The total ion chromatograms of the polar fraction of Fir

一元、二元、三元溶劑超聲波抽提冷杉樣品所得脂溶性物質(zhì)極性餾分的4種生物標(biāo)志化合物參數(shù)的差別較小,列于表6。表明上述3種溶劑對(duì)冷杉的超聲波抽提物極性餾分中生物標(biāo)志化合物的表征差別不大。

表6 冷杉極性餾分的參數(shù)表Table 6 The parameter table of the polar fraction of Fir

EOPf和CPIA值都是判識(shí)脂肪酸奇偶碳優(yōu)勢(shì)的參數(shù)[10]。在高等植物原生質(zhì)中,正構(gòu)脂肪酸呈現(xiàn)絕對(duì)的偶碳優(yōu)勢(shì)。所研究不同溶劑冷杉超聲抽提物的 EOPf和CPIA值相似,表明3種不同溶劑經(jīng)超聲波抽提得到極性餾分特征相似,即極性餾分中脂肪酸的分布并未受到不同溶劑抽提的影響。同時(shí),EOPf和CPIA值顯示冷杉脂肪酸系列并未受到降解因素的影響,仍保留原生質(zhì)中強(qiáng)烈的偶碳數(shù)優(yōu)勢(shì)特征。比較冷杉中關(guān)于正構(gòu)烷烴的分布特征,發(fā)現(xiàn)在冷杉離株之后的熱力及細(xì)菌-微生物作用的降解過(guò)程對(duì)正構(gòu)烷烴有較明顯的影響,但脂肪酸系列卻基本保持原貌。

在脂肪酸中,異構(gòu)脂肪酸的存在是細(xì)菌微生物發(fā)育的證據(jù)之一[11-14],也就是說(shuō),在高等植物原生質(zhì)中,脂肪酸一般都是以正構(gòu)脂肪酸的形式存在,而在其離株之后的細(xì)菌作用下,正構(gòu)脂肪酸逐漸轉(zhuǎn)化為異構(gòu)脂肪酸。因此,可以用∑iCn∶0/ ∑nCn∶0值 (異構(gòu)脂肪酸與正構(gòu)脂肪酸的比值)來(lái)作為判識(shí)細(xì)菌作用程度的參數(shù),即該值越大,樣品受細(xì)菌微生物的作用越強(qiáng)烈,反之樣品受細(xì)菌微生物的作用越弱。所研究的冷杉脂溶性物質(zhì)極性餾分值約為0.130,說(shuō)明其受過(guò)細(xì)菌微生物的作用,但受降解的程度并不強(qiáng)烈。

3 結(jié)論

1)有機(jī)溶劑超聲抽提法分離天然有機(jī)產(chǎn)物中脂溶性物質(zhì),由于其時(shí)間短而且抽提率較高,可作為有效的分離方法在實(shí)驗(yàn)室中使用。

2)從冷杉不同溶劑的超聲抽提所得到的脂溶性物質(zhì)抽提率來(lái)看,一元溶劑＞二元溶劑＞三元溶劑。

3)不同溶劑的超聲抽提物經(jīng)柱色層族組成分離結(jié)果表征,雖然非極性和強(qiáng)極性餾分的3種溶劑抽提法分布特征相同,但弱極性餾分以一元溶劑得到的信息最為豐富,因此一元溶劑氯仿超聲波抽提法是最佳的。

4)研究表明,植物離株之后若在室溫空氣中保存,則易受到細(xì)菌-微生物的降解作用,主要受降解影響的是正構(gòu)烷烴系列的去甲基和鏈斷裂效應(yīng)增強(qiáng),主要表現(xiàn)為高碳數(shù)正構(gòu)烷烴向低碳數(shù)降解的過(guò)程。因此,在研究天然有機(jī)物時(shí),所研究的植物為避免受到細(xì)菌微生物的作用,應(yīng)該在植物離株后及時(shí)密封保存,盡量與空氣隔絕,以保持植物本身的生物特征。

致謝:感謝中國(guó)科學(xué)院青藏高原研究所白艷博士后提供的冷杉樣品。

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Com ponen t Analysis of L ipid-Soluble Substances Extracted by Different Solvents from Fir by GC/MS

SUN M in-zhuo,M ENG Qian-xiang,FANG Xuan,XU Yin
(Key Laboratory of Petroleum Resources Research,Institute of Geology and Geophysics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

The chem ical components of lipid-soluble substances f rom Fir w ere extracted by ultrasonic extraction with the single solvent(chloroform),the binary solvents(V(chloroform)∶V(methanol)=3∶1)and the ternary solvents(V(chlo roform)∶V(methanol)∶V(acetone)=4∶1∶1)respectively,separated and identified by gas chromatography-mass spectrometry(GC/M S).The results show that the extraction rate,composition and their contents of lipid-solvent substances are notably varied by different solvents.The single solvent(chloroform)for extracting lipid-solvent substances is better than the other in raising yield and chemical composition,which is an ideal solvent for extracting of lipid soluble substances from Fir.

Fir;ultrasonic extraction;lipid-soluble substances;gas chromatography-mass spectrometry(GC/M S)

O657.63

A

1004-2997(2011)04-0222-07

2011-01-21;

2011-05-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(40703001)資助

孫敏卓(1979～),女(漢族),陜西岐山人,助理研究員,從事氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和生物標(biāo)志化合物研究。E-mail:sunmz04@sina.com