關(guān)鍵，孫妍，孫筱璐，梁巖，王國干

阿托伐他汀對小鼠病毒性心肌炎心肌細胞凋亡的影響研究*

關(guān)鍵＊＊，孫妍，孫筱璐，梁巖，王國干

目的:阿托伐他汀鈣(atorvastatin)對減少小鼠病毒性心肌炎(VMC)心肌細胞凋亡的影響。

方法:4周齡小鼠146只按隨機數(shù)字法分為4組:正常對照組(正常組，n=18);病毒性心肌炎組(VMC組，n=60);阿托伐他汀鈣藥物對照組(對照組，n=18);阿托伐他汀鈣治療病毒性心肌炎組(VMC藥物治療組，n=50)。VMC組及VMC藥物治療組小鼠腹腔接種柯薩奇病毒，正常組及對照組未注射病毒，VMC組及VMC藥物治療組小鼠給予阿托伐他汀鈣，連續(xù)用藥2周。用藥后3、7、10、14、21、30天，蘇木素-伊紅染色觀察心肌組織炎癥浸潤程度，電鏡觀察心肌膠原纖維及各種細胞器的變化。缺口末端標記法(TUNEL)檢測心肌細胞凋亡情況。反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶連鎖反應(yīng)(RT-PCR)及蛋白質(zhì)印跡方法檢測心肌脂肪酸合成酶(Fas)信使核糖核酸(mRNA)和蛋白的表達水平。

結(jié)果:VMC組比VMC藥物治療組的30天累計生存率低，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.008)。VMC藥物冶療組比VMC組在第10、14、21、30天的心肌病理組織學積分均減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。VMC藥物治療組比VMC組心肌損傷的病灶數(shù)量少，心肌線粒體和肌漿網(wǎng)改變也較同期VMC組輕。第14、21天VMC藥物治療組比VMC組凋亡指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。VMC組比正常組FasmRNA和蛋白的表達均增加，VMC藥物治療組比VMC組Fas mRNA和蛋白的表達均減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

結(jié)論:阿托伐他汀鈣改善VMC小鼠生存率，改善組織病理學表現(xiàn)，其機制可能與通過下調(diào)Fas轉(zhuǎn)錄及表達，從而抑制心肌細胞凋亡有關(guān)。表明阿托伐他汀鈣對VMC小鼠有明顯的保護作用。關(guān)鍵詞 病毒性心肌炎;阿托伐他汀鈣;凋亡;心肌脂肪酸合成酶*基金項目:國家博士點基金資助(2006-GB05)

(Chinese Circulation Journal，2011，26:220.)

病毒性心肌炎(VMC)發(fā)病率呈逐年增高趨勢［1］，柯薩奇病毒 B3(CVB3)是 VMC的重要病原體［2］。VMC的發(fā)病機制與病毒對心肌的直接損傷和免疫反應(yīng)對心肌的損傷有關(guān)［3］。已證實病毒感染心肌細胞時可同時啟動細胞凋亡途徑，在VMC的發(fā)病中起重要作用［4］。脂肪酸合成酶(Fas)是一種跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，它與脂肪酸合成酶配體(FasL)結(jié)合可以啟動凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細胞凋亡［5］。他汀類藥物是臨床應(yīng)用的降脂藥物［6］，還具有獨立于降脂效應(yīng)以外的免疫調(diào)節(jié)和影響細胞凋亡的作用［7］。本文探討阿托伐他汀鈣(atorvastatin)對減少小鼠病毒性心肌炎(VMC)心肌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

分組及標本采集制備:本研究2007-09至2009-05，取4周齡健康雄性近交系純種 Balb/c小鼠146只，體重約10～11 g。小鼠按隨機數(shù)字法分為4組:正常對照組(正常組，n=18)，病毒性心肌炎組(VMC組，n=60)，阿托伐他汀鈣藥物對照組(對照組，n=18)，阿托伐他汀鈣治療病毒性心肌炎組(VMC藥物治療組，n=50)。VMC 小鼠模型的建立［8］:腹腔接種0.3 ml M株CVB3病毒，濃度為3×103PFU/mL。正常組及對照組腹腔無菌注射不含病毒的培養(yǎng)液。注射當天為第0天，對照組及VMC藥物治療組從第3天給予阿托伐他汀鈣10 mg/(kg·d)，VMC組給予等體積飲用水，以灌胃器給藥，連續(xù)用藥 2 周。在第 3、7、10、14、21、30天各組小鼠取血后處死并留取心臟。將血離心取血清-80℃冰箱保存;將心臟一半用4%多聚甲醛固定3天做伊紅染色、免疫組化等檢查，心臟另一半用液氮凍存待做逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡(Western blot)等檢查。各組隨機取兩只小鼠心肌標本2～3 mm3用3%戊二醛固定送電鏡檢查。

一般觀察:觀察動物的進食進水量，糞便情況，活動力，觀察毛發(fā)以及神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等情況。記錄死亡情況。

光鏡觀察:小鼠心臟4%多聚甲醛固定3天后，常規(guī)制片蘇木素-伊紅染色，觀察組織切片心肌細胞損傷、炎性細胞浸潤或組織損傷的程度，參照Rezkalla方法計算心肌病理組織學積分:每張切片取5個高倍視野，計算每個視野中炎性細胞浸潤及壞死區(qū)域與整個視野面積之比:無病變計0分，病變面積＜25%計1分，26～50%計2分，51～75%計3分，＞76%計4分［9］。

電鏡觀察:小鼠心臟標本用3%戊二醛固定后，常規(guī)制樣。觀察心肌膠原纖維、心肌細胞及各種細胞器和細胞間隙的變化。

脫氧核糖核酸(RNA)缺口末端標記法(TUNEL)檢測小鼠心肌細胞凋亡情況:根據(jù)缺口末端標記法試劑盒(羅氏公司 美國)的說明書進行操作，檢測各組小鼠的心肌細胞凋亡情況，計算并比較心肌細胞凋亡指數(shù)。每張切片于200倍光鏡下，隨機選擇5個無重復(fù)的亮視野，計數(shù)呈深褐色的TUNEL陽性細胞核以及所有細胞核。細胞凋亡指數(shù)=平均陽性染色細胞核數(shù)/所有細胞核數(shù)×100。

反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶連鎖反應(yīng)檢測心肌組織信使核糖核酸(mRNA)表達:提取心肌標本的總核糖核酸，用第一鏈脫氧核糖核酸(cDNA)合成試劑盒(MBI公司，美國)合成 cDNA。Fas的引物意義鏈為:5-GCACAGAAGGGAAGGAGTAC-3，反意義鏈為:5-CTCTTCAGCAATTCTCGGGA-3。產(chǎn)物長度452 bp。β肌動蛋白(β-actin)引物意義鏈為:5-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3，反 意 義 鏈 為:5-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3。產(chǎn)物是353 bp(上海生工生物工程公司 中國)。PCR的反應(yīng)條件為:94℃ 3 min預(yù)變性，隨后 94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，擴增 22 個循環(huán)，72℃延伸10 min。產(chǎn)物于1.5%含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳，紫外檢測儀觀察照相，以β肌動蛋白為內(nèi)參計算相對灰度。

蛋白質(zhì)印跡檢測心肌組織中Fas蛋白的表達:具體步驟如下，提取組織蛋白，配置5%的濃縮膠及12%的分離膠，取24μg總蛋白加入6μl 5×凝膠上樣緩沖液，煮沸5 min后加入凝膠加樣孔，以100 V電壓進行電泳2 h。電泳結(jié)束后取出凝膠，應(yīng)用濕式轉(zhuǎn)移電泳槽在200 mA穩(wěn)流條件下進行電轉(zhuǎn)移2 h。電轉(zhuǎn)移完成后將聚偏氟乙烯(PVDF)膜置于封閉液中1 h。加入Fas抗體(Santa Cruz，美國)4℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，37℃孵育1 h，洗滌后應(yīng)用化學發(fā)光試劑盒進行化學增強發(fā)光及X膠片顯色。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)做內(nèi)參。采用 Image-ProPlus軟件(Version 4.1，Media Cybernetics，LP，USA)分析照片中蛋白條帶的灰度。

統(tǒng)計學方法:各參數(shù)以均數(shù)±標準差表示，計數(shù)資料組間比較采用方差分析或非配對t檢驗，分級資料用非參數(shù)統(tǒng)計Two-Sample Kolmogorov-Smirnov Test方法。生存曲線由Kaplan-Meier法完成，post-hoc檢驗用于比較各組生存率間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。SPSS 11.0統(tǒng)計軟件協(xié)助處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

一般觀察及生存率:正常組與對照組小鼠一般情況好。VMC組小鼠腹腔注射病毒后第3天開始出現(xiàn)聳毛，拱背，懶動，飲水進食減少，體重減輕;第4天出現(xiàn)死亡;第7～14天為死亡高峰。VMC藥物治療組也有上述癥狀出現(xiàn)，但表現(xiàn)較輕。VMC組比VMC藥物治療組的30天累計生存率低(59.2%vs 87.0%)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.008)。各組小鼠30天累計生存率分析見圖1。

圖1 阿托伐他汀對各組小鼠30天累計生存率的影響。病毒性心肌炎組與阿托伐他汀鈣治療病毒性心肌炎組比較P=0.008。

光鏡觀察:病毒性心肌炎小鼠尸檢見心外膜表面有大面積白色滲出物。心肌組織檢測正常組與對照組均未見病理性改變。VMC組:小鼠感染CVB3后，第3天心肌未見顯著改變，第7天心肌細胞出現(xiàn)混濁腫脹，結(jié)構(gòu)不清，胞漿染色嗜酸性增強，可見少許炎性細胞浸潤，第10天出現(xiàn)炎性細胞灶性浸潤，心肌呈透明樣變性，胞核碎裂或者消失，間質(zhì)水腫，第14天，大量炎性細胞浸潤，廣泛心肌壞死，壞死灶周圍可見鈣化灶，第21天，心肌細胞壞死，肌纖維溶解吸收，可見壞死后空架，第30天，壞死灶形成瘢痕。VMC藥物冶療組比VMC組心肌病理組織學積分在第10天(0.56 vs 1.72)，14天(1.16 vs 2.12)，21 天(0.64 vs 1.6)，30 天(0.12 vs 0.92)均減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

電鏡觀察:VMC組的非炎癥灶內(nèi)的心肌細胞肌漿網(wǎng)明顯擴張，線粒體腫脹、嵴斷裂溶解，線粒體有空泡化，并有髓鞘樣結(jié)構(gòu)形成，部分心肌細胞核固縮，肌原纖維溶解消失，線粒體鈣化，細胞崩解，多數(shù)囊泡形成。有灶性心肌壞死，代以單核和淋巴細胞浸潤。VMC藥物治療組比VMC組心肌損傷的病灶數(shù)量少，心肌線粒體和肌漿網(wǎng)改變也較同期VMC組輕。

脫氧核糖核酸(RNA)缺口末端標記法檢測小鼠心肌細胞凋亡:凋亡細胞的細胞核有深褐色的染色。正常組和對照組心肌細胞的凋亡指數(shù)為0。VMC組和VMC藥物治療組的小鼠心肌中可見調(diào)亡細胞，第14、21天VMC藥物治療組比VMC組凋亡指數(shù)降低(3.62 vs 12.36;1.37 vs.4.33，n=5)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

脂肪酸合成酶表達的檢測:第14天反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶連鎖反應(yīng)檢測心肌組織Fas信使核糖核酸表達，VMC組比正常組FasmRNA的表達顯著增加［(1.04±0.18)vs(0.6±0.1)］;VMC藥物治療組比VMC組Fas mRNA的表達顯著減少［(0.80±0.18)vs(1.04±0.18)］，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖2)。

蛋白質(zhì)印跡檢測心肌組織中Fas蛋白表達:第14天VMC組比正常組Fas蛋白的表達顯著增加［(0.31±0.09)vs(0.20±0.07)］;VMC藥物治療組比 VMC組Fas蛋白表達減少［(0.23±0.08)vs(0.31±0.09)］差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖3)。

圖2 阿托伐他汀對各組小鼠FasmRNA表達的影響 圖3 阿托伐他汀對各組小鼠Fas蛋白表達的影響 與正常對照組比較*P＜0.01;與病毒性心肌炎組比較△P＜0.05;與病毒性心肌炎組比較▲P＜0.01 Fas:脂肪酸合成酶 mRNA:信使核糖核酸 β-actin:β-肌動蛋白 GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶 1:正常對照組 2:病毒性心肌炎組 3:阿托伐他汀鈣藥物對照組 4:阿托伐他汀鈣治療病毒性心肌炎組

3 討論

他汀類藥物是有效而安全的降脂藥物。近來逐漸認識到它除具有降脂作用外，還有調(diào)節(jié)免疫與抑制細胞凋亡的作用。既往研究表明他汀藥物可以糾正VMC中輔助性T淋巴細胞亞群分化的不平衡，抑制主要組織相容性抗原Ⅱ的表達，抑制VMC過度的炎癥和免疫反應(yīng)［10］。

在感染性急性心肌炎中，直接病毒介導(dǎo)的損傷和病毒感染細胞的免疫介導(dǎo)損傷都能促成心肌損害。細胞毒T淋巴細胞(CTL)是一種特異T細胞，專門分泌各種細胞因子參與免疫作用。它介導(dǎo)的細胞毒性作用是VMC心肌細胞損傷的主要原因。Fas途徑是T淋巴細胞致靶細胞凋亡的主要途徑之一。當激活的細胞毒T淋巴細胞經(jīng)Fas/FasL與靶細胞結(jié)合時，便可將凋亡信號轉(zhuǎn)入后者，使靶細胞發(fā)生凋亡。有研究報道在心肌炎患者的心肌標本中存在較多的凋亡心肌細胞，提示凋亡可能是心肌炎心肌損害的機制之一;而且還發(fā)現(xiàn)阻斷凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可有效治療心肌炎。一些凋亡調(diào)節(jié)蛋白，如:B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)，Bcl-xL已證實參與了CVB的復(fù)制，誘導(dǎo)并激活了凋亡程序，參與 VMC 的病理變化［11，12］，本研究得到相似的結(jié)果。

本研究表明病毒性心肌炎模型制作成功，阿托伐他汀可以抑制柯薩奇病毒誘導(dǎo)的小鼠VMC的進展，改善VMC癥狀，減輕VMC的心肌損傷，降低小鼠死亡率。為進一步探尋阿托伐他汀鈣對VMC保護作用的可能機制，本研究用缺口末端標記法、反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶連鎖反應(yīng)、蛋白質(zhì)印跡等方法觀察，見非炎癥灶內(nèi)的心肌有凋亡增多，而阿托伐他汀鈣對它有抑制作用，同時研究也觀察到小鼠心肌細胞凋亡和心肌組織中Fas表達水平相應(yīng)變化，表明阿托伐他汀鈣對VMC小鼠心肌中Fas系統(tǒng)有影響。蛋白質(zhì)印跡和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的結(jié)果亦分別提示VMC組心肌組織中Fas表達水平顯著上調(diào)。同時也證實了VMC小鼠心肌組織中存在Fas介導(dǎo)的細胞凋亡。VMC藥物治療組心肌細胞凋亡減少，30天時與VMC組比較，細胞凋亡顯著減少。Fas表達水平在阿托伐他汀鈣組較VMC組也減低。說明阿托伐他汀可抑制細胞凋亡，其作用機制可能與其抑制Fas表達有關(guān)。這可能是治療VMC的新途徑。至于治療組心肌組織炎癥浸潤較VMC組減輕的原因難以完全用心肌細胞的凋亡來解釋，其原因有待進一步探索。

總之，本研究的結(jié)果提示阿托伐他汀減少病毒誘導(dǎo)的VMC心肌損害的嚴重程度，可以抑制模型動物心肌細胞凋亡和Fas的表達。阿托伐他汀對于VMC小鼠的治療獲益有可能和抑制Fas表達和細胞凋亡有關(guān)。

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(助理編輯:曹洪紅)

Atorvastatin Inhibits Cardiom yocyte Apoptosis in Viral Myocarditis M ice

GUAN Jian＊＊＊，SUN Yan，SUN Xiao-lu，LIANG Yan，WANG Guo-Gan.
Department of Emergency，Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital，CAMS and PUMC，Beijing(100037)，China Corresponding Author:WANG Guo-Gan，Email:wangguog@263.net

Objective:To investigate the inhibition effect of atorvastatin on cardiomyocyte apoptosis in viralmyocarditis(VMC)mice.

Methods:The VMCmodelwas induced by Coxsakie virus B3 injection，and themice were divided into four groups.Normal control group，n=18，VMC group，n=60，Atorvastatin control group，n=18，in which themice were treated with Atorvastatin，and VMC+Atorvastatin group，n=50.The animals received Atorvastatin 3 days after virus injection and the medication lasted for 2 weeks.3，7，10，14，21，and 30 days after themedication，themyocardial inflammation was examined by histochemistry staining，the cardiomyocyte apoptosis was determined by TdT-mediated Dutp nick end labeling(TUNEL)method，fatty acid synthase(FAS)mRNA and protein expression were detected by RT-PCR and western blot analysis respectively.

Results:Compared with VMC group，the 30 days survival rate was higher in VMC+Atorvastatin group，it also presented the improved the pathological features at10，14，21 and 30 days after themedication，TUNEL indicated that the cardiomyocyte apoptosis wasmuch lower in VMC+Atorvastatin group at14 and 21 days after themedication，P＜0.05 respectively.RT-PCR and western blot analysis revealed that the FASmRNA and protein expression were both increased in VMC group than that in Normal control group，were both decreased in VMC+Atorvastatin group than that in VMC group，P＜0.05 respectively.

Conclusion:Atorvastatin improves the survival rate and the pathological features in VMCmice，whichmightbe because of the down regulation of Fas expression and therefore，inhibit the cardiomyocyte apoptosis.

Viralmyocarditis;Atorvastatin;Apoptosis;Fatty acid synthase

100037 北京市，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 心血管病研究所 阜外心血管病醫(yī)院 心內(nèi)科(關(guān)鍵、孫筱璐、梁巖、王國干);北京煤炭總醫(yī)院 心臟中心(孫妍)

關(guān)鍵 主治醫(yī)師 博士 研究方向為心力衰竭 Email:gj7346@sina.com 通訊作者:王國干 Email:wangguog@263.net＊＊現(xiàn)工作于清華大學第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科＊＊＊Now working at the First Affiliated Hospital of Tsinghua University

R541

A

1000-3614(2011)03-0220-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2011.03.017

2011-01-17)

·臨床研究·