葉宗果 雍蘇南 嚴(yán)浩成

1廣東省新豐縣人民醫(yī)院（廣東新豐510095）

2湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（湖南長沙410007）

3廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所（廣東廣州510405）

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性wistar大鼠50只、體質(zhì)量（275±30）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬2007-0005）。

1.2 藥物 選擇保元湯（黃芪、人參、肉桂、甘草）為補(bǔ)氣法之載體，瓜蔞薤白半夏湯（瓜蔞、薤白、半夏、白酒）為化痰法之載體。藥材均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。

1.3 儀器與試劑 Micro-ESR型電子自旋共振波譜儀，美國產(chǎn)；TD5-Ⅱ臺(tái)式離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司生產(chǎn)；721分光光度計(jì)，上海第三儀器廠生產(chǎn)；SSW型電熱恒溫水槽，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司提供；Thermo Shandon切片機(jī)，英國產(chǎn)；LKB-Ⅱ型超薄切片機(jī)，瑞典產(chǎn)；OPTON萬能光學(xué)顯微鏡，德國產(chǎn)；H-600透射電鏡，日本產(chǎn)。原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Bcl-2、Bax免疫組化檢測(cè)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）,丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 分組及造模 參照文獻(xiàn)［2］的方法，制備高脂乳劑，對(duì)50只wistar大鼠按10mL/kg灌胃，每日1次，連續(xù)12周。隨機(jī)抽取2只大鼠，處死后速取主動(dòng)脈，浸入4%多聚甲醛溶液中，固定48h，石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)已形成粥樣硬化斑塊，提示造模成功。隨機(jī)分成4組，即假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)氣法組、化痰法組，每組10只動(dòng)物。在大鼠AS模型的基礎(chǔ)上，手術(shù)建立大鼠MIRI模型：大鼠稱體質(zhì)量后，予氯胺酮80mg/kg經(jīng)腹腔注射麻醉。氣管切開接呼吸機(jī)人工呼吸，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。開胸后以左冠狀靜脈主干為標(biāo)志結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈。以心電圖ST段明顯抬高、結(jié)扎點(diǎn)遠(yuǎn)端心肌發(fā)紺為結(jié)扎成功標(biāo)志。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30min，復(fù)流3h。假手術(shù)組，只穿線不結(jié)扎冠脈。

1.5 給藥方法 保元湯、瓜蔞薤白半夏湯水煎劑參考文獻(xiàn)［3］制備。給藥劑量按60kg成人與動(dòng)物體表面積換算，保元湯以0.95g生藥/kg灌胃，瓜蔞薤白半夏湯以0.59g生藥/kg灌胃，給藥體積均按1mL/100g計(jì)算，于缺血再灌注前30min給大鼠灌胃，模型組及假手術(shù)組注入等量生理鹽水。

1.6 心肌凋亡細(xì)胞原位檢測(cè) 采用原位末端TUNEL法標(biāo)記凋亡心肌細(xì)胞，具體操作步驟按照試劑說明書進(jìn)行。每張切片隨機(jī)于×400物鏡下取5個(gè)視野，每組共40個(gè)視野，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡陽性細(xì)胞，計(jì)數(shù)凋亡陽性細(xì)胞，以凋亡指數(shù)(AI）反映各組心肌細(xì)胞凋亡的情況。AI=（視野內(nèi)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)/視野內(nèi)所有心肌細(xì)胞個(gè)數(shù)）×100%。

1.7 Bcl-2、Bax基因蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用鏈酶親和素-生物素-酶復(fù)合物 （SABC）免疫組化檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。在光鏡下200倍放大，通過圖像分析系統(tǒng)每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，胞漿著棕黃色者為陽性表達(dá)細(xì)胞，測(cè)定陽性染色的平均光密度與陽性細(xì)胞百分比，計(jì)算蛋白陽性表達(dá)指數(shù)（PEI）：PEI=平均光密度×陽性細(xì)胞百分比×100，并求出Bax／Bcl-2的比值。

1.8 氧自由基的檢測(cè) 采用電子共振自旋波頻譜儀定量檢測(cè)心肌細(xì)胞氧自由基量。用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)血清SOD活性，用硫代巴比妥（TBA）法檢測(cè)MDA含量。

2 結(jié) 果

2．1 對(duì)各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 見表1。光鏡下觀察，假手術(shù)組偶見凋亡陽性細(xì)胞，模型組有大量的心肌細(xì)胞凋亡，且積聚成團(tuán)，AI顯著高于假手術(shù)組（P＜0．01）。補(bǔ)氣法組、化痰法組心肌細(xì)胞 AI均較模型組明顯減少（P＜0．01）。

表1 各組大鼠AI及凋亡相關(guān)蛋白水平比較 （±s）

表1 各組大鼠AI及凋亡相關(guān)蛋白水平比較 （±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0．01；與模型組比較，△P＜0．05。 下同。

組 別 n AI（%） Bc1-2蛋白 Bax蛋白 Bax/Bcl-2假手術(shù)組 10 3．30±0．70 0．22±0．03 0．23±0．04 0．88±0．34模型組 10 29．60±7．10* 7．32±2．03* 18．44±5．59* 3．27±0．11*補(bǔ)氣法組 10 15．40±5．80*△△ 7．48±2．02* 18．14±5．41* 3．26±0．11*化痰法組 10 16．70±5．50*△△ 17．62±4．89*△△ 5．40±1．21*△△ 0．35±0．57*△△

2．2 對(duì)各組大鼠Bcl-2與Bax基因蛋白表達(dá)的影響 見表1。在假手術(shù)組中，Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量都較少，Bax/Bcl-2比值接近1；與假手術(shù)組比較，模型組Bcl-2和Bax的表達(dá)量均有所上升（P＜0．01），但以 Bax 蛋白表達(dá)更明顯，Bax／Bcl-2 顯著增高（P＜0．01）；與模型組比較，補(bǔ)氣法組Bcl-2和Bax的表達(dá)量無明顯上升（P＞0．05）； 化痰法組 Bcl-2 的表達(dá)量顯著升高（P＜0．01），Bax 的表達(dá)量則明顯下降（P＜0．01），Bax／Bcl-2 也顯著低于模型組（P＜ 0．01）。

2．3 對(duì)各組大鼠心肌SOD、MDA含量的影響 見表2。假手術(shù)組心肌組織的SOD具有較高的活性，MDA處于較低的水平。模型組同假手術(shù)組比較，則有明顯的氧化趨勢(shì)，SOD活性顯著降低（P＜ 0．01），MDA 含量顯著增高（P ＜ 0．01）；同模型組比較，補(bǔ)氣法組、化痰法組 MDA 含量降低（P＜0．01），SOD活性顯著增高（P＜0．05 或 0．01）；補(bǔ)氣法在降低 MDA 含量、升高 SOD 活性方面優(yōu)于化痰法，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

表2 各組大鼠血清SOD活性與MDA含量比較 （±s）

表2 各組大鼠血清SOD活性與MDA含量比較 （±s）

與補(bǔ)氣法組比較，▲P＜0．05。

MDA（μmol/g）假手術(shù)組 10 2．85±0．32 5．92±1．23模型組 10 1．33±0．14* 17．20±2．48*補(bǔ)氣法組 10 2．20±0．25*△△ 7．85±1．72*△△化痰法組 10 1．80±0．22*△▲ 9．54±1．63*△△▲組 別 n SOD（mkat/g）

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷是急性心肌梗死早期再灌注治療過程中一個(gè)嚴(yán)重的并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn)，再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)是心肌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，心肌缺血再灌注后凋亡明顯增多，而使用2種不同中醫(yī)治法的方藥后凋亡細(xì)胞明顯減少，說明中醫(yī)補(bǔ)氣法、化痰法均可減輕心肌缺血再灌注損傷。

在心肌缺血再灌注損傷中，凋亡的發(fā)生是受細(xì)胞周圍的刺激信號(hào)誘導(dǎo)或抑制，并由特定的基因控制。Bax基因與Bc1-2基因具有高度的同源序列，Bax蛋白與Bc1-2蛋白可相互結(jié)合形成結(jié)合體，過度表達(dá)Bax蛋白可促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制Bcl-2的抗凋亡作用。因此，Bax和Bc1-2表達(dá)的比例決定細(xì)胞是生存還是凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組中Bcl-2和Bax及凋亡細(xì)胞表達(dá)很少，而模型組Bcl-2表達(dá)增加，有報(bào)道認(rèn)為與心肌細(xì)胞受到缺血再灌注過程的刺激而反應(yīng)性表達(dá)，以提高細(xì)胞的內(nèi)在抵抗能力有關(guān)［4］。 但 Bax 表達(dá)更多，Bax／Bcl-2 比值增大，凋亡細(xì)胞增多，這進(jìn)一步證明了Bax／Bcl-2比值與細(xì)胞凋亡的密切關(guān)系。給予2種不同治法的方藥后，化痰法組Bc1-2表達(dá)上調(diào)，Bax表達(dá)下調(diào)，Bax／Bcl-2比值下降，而補(bǔ)氣法組的Bax和Bc1-2表達(dá)無明顯改善，提示化痰法可上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞的凋亡，以減輕心肌缺血再灌注損傷，而補(bǔ)氣法可能從其他分子途徑拮抗MIRI。

心肌細(xì)胞內(nèi)氧自由基大量產(chǎn)生是再灌注心肌損傷發(fā)病的重要機(jī)制之一。SOD是體內(nèi)存在的一種抗氧自由基酶,其活力的高低間接反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基（OFR）的能力［5］,MDA為OFR發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程中形成的脂質(zhì)過氧化物,其水平間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。兩者的變化可反映心肌的抗氧化能力［6］。本實(shí)驗(yàn)顯示：與模型組比較，2個(gè)中藥治療組大鼠在經(jīng)歷心肌缺血再灌注后，其SOD活性均明顯增高，MDA含量均明顯降低，提示中醫(yī)補(bǔ)氣法、化痰法均能夠有效清除氧自由基，提高機(jī)體抗氧化能力。但化痰法組在增高SOD活性及降低MDA含量方面均無補(bǔ)氣法組明顯，說明中醫(yī)補(bǔ)氣法、化痰法均能通過促進(jìn)清除大鼠心肌細(xì)胞心肌缺血再灌注時(shí)所產(chǎn)生的氧自由基，但化痰法的作用效果不及補(bǔ)氣法。

本實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)氣法則主要通過清除OFR來預(yù)防缺血再灌注時(shí)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，減輕損傷。而化痰法主要通過清除OFR，上調(diào)Bcl-2表達(dá)、下調(diào)Bax表達(dá)，最終達(dá)到保護(hù)心肌的目的。兩種中醫(yī)治法均能有效預(yù)防MIRI后的細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌缺血再灌注損傷有良好的保護(hù)作用。

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