楊民正，梁慶模

（1.永州市人民醫(yī)院，湖南 永州 425006；2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，湖南 衡陽 421001）

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是臨床常見的十大惡性腫瘤之一，約占頭頸部惡性腫瘤的50%以上[1]。NPC的CT掃描是判定鼻咽癌淺層受累、深部蔓延、顱底骨質(zhì)破壞及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有效手段[2]。這些CT征象是由腫瘤的組織病理學(xué)特性及生物學(xué)行為所決定的。Annexin A7的表達(dá)水平和空間分布的變化與多種類型腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移進(jìn)程密切相關(guān)，從而影響惡性腫瘤的組織病理學(xué)特性。分析NPC的CT表現(xiàn)與Annexin A7蛋白異常表達(dá)的關(guān)系，研究影像學(xué)表現(xiàn)的分子病理學(xué)基礎(chǔ)，將會(huì)提高對(duì)NPC CT表現(xiàn)的認(rèn)識(shí)水平。

本研究通過研究Annexin A7表達(dá)與NPC分化、轉(zhuǎn)移及CT征象的關(guān)系，分析其與NPC臨床預(yù)后的相關(guān)性，對(duì)NPC的惡性度及預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，從而為臨床診治提供更有價(jià)值的信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料

湖南省永州市人民醫(yī)院2008年1月～2010年1月手術(shù)標(biāo)本，58例NPC患者、20例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性鼻咽癌（LMNPC）和24例慢性鼻咽炎患者的石蠟標(biāo)本。CT檢查后均經(jīng)病理活檢證實(shí)。全部標(biāo)本均用10%福爾馬林固定，石蠟包埋。5μm連續(xù)切片。

1.2 試劑

Annexin A7兔抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司、SP免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 CT掃描方法

CT掃描設(shè)備為Siemens Sensation 16層螺旋CT掃描機(jī)。病人取常規(guī)仰臥位，平靜呼吸，顱底掃描平面與OM線平行，掃3～4層，層厚、層距5mm，鼻咽區(qū)CT常規(guī)軸位平掃，層厚、層距5mm，從鼻咽頂壁掃至口咽，口咽以下，加3～4層，層厚、層距10mm，部分病例同時(shí)做冠狀位掃描和增強(qiáng)掃描。增強(qiáng)掃描的方法及范圍與軸位平掃一致，所使用的碘對(duì)比劑為江蘇揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)的非離子型碘對(duì)比劑30%碘海醇注射液，劑量為60～100ml，注射方法采用靜脈團(tuán)注法，注射速率為2～3ml/s。

1.4 免疫組織化學(xué)方法

免疫組織化學(xué)染色采用S-P法進(jìn)行。主要步驟:①石蠟切片脫蠟至水，PBS洗3次，每次3min；②抗原修復(fù)：將處理好的切片置于枸櫞酸鹽緩沖液的燒杯中，加熱至沸騰5min，自然冷卻至室溫，PBS液沖洗兩次；③每張切片加一滴過氧化物酶阻斷溶液（試劑A），室溫下孵育10min。PBS沖洗3次，每次3min；④除去PBS液，加一滴正常非免疫動(dòng)物血清（試劑B），室溫下孵育10min；⑤除去血清，分別加入兔抗人Annexin A7抗體（1∶150稀釋），4℃過夜。用PBS代替一抗為陰性對(duì)照，PBS沖洗3次，每次3min；⑥每張切片加一滴生物標(biāo)記的二抗（試劑C），室溫下孵育 10min。PBS 沖洗 3 次，每次 3min；⑦每張切片加一滴鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液（試劑D），室溫下孵育10min。PBS沖洗3次，每次3min；⑧每張切片加二滴新鮮配置的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10min；⑨自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗返藍(lán)；⑩梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.5 結(jié)果判斷

Annexin A7免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)定位于胞漿和胞膜，隨機(jī)選取至少10個(gè)高倍鏡視野（×200），至少計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，以積分法計(jì)算結(jié)果。即根據(jù)每張切片的染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例計(jì)分。著色強(qiáng)度：無色0分；淺黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。著色細(xì)胞比例：無著色0分；＜30%為1分；30%～60%為2分；≥60%為3分。兩者相加0～2分為弱陽性或陰性，3～4分為陽性，5～6分為強(qiáng)陽性。陽性率＝（陽性數(shù)+強(qiáng)陽性數(shù)）/總例數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組間比較采用ANOVA檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Annexin A7蛋白在NPC、LMNPC和慢性鼻咽炎鼻咽上皮中的表達(dá)

NPC患者中Annexin A7陽性率為87.9%（51/58），LMNPC 中陽性率為 95.0%（19/20），對(duì)照組慢性鼻咽炎鼻咽上皮中陽性率為41.7%（10/24），Annexin A7表達(dá)在LMNPC中高于NPC，NPC中高于對(duì)照組，差異有顯著性意義（表 1，圖 1，P＜0.05）。

2.2 Annexin A7蛋白表達(dá)與NPC臨床病理特征的關(guān)系

圖1 NPC、LMNPC和慢性鼻咽炎鼻咽上皮中Annexin A7表達(dá)情況。圖1a：慢性鼻咽炎鼻咽上皮；圖1b：中分化 NPC；圖 1c：低分化 NPC；圖 1d：LMNPC。Figure 1.The expression of Annexin A7 in NPC,LMNPC and chronic rhinitis(CR).Figure 1a:CR;Figure 1b:Moderate-differentiated NPC;Figure 1c:Low-differentiated NPC;Figure 1d:LMNPC.

表1 鼻咽癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性鼻咽癌和慢性鼻咽炎鼻咽上皮中Annexin A7的表達(dá)情況

表2 Annexin A7表達(dá)與NPC臨床病理特征關(guān)系

Annexin A7表達(dá)與組織分化程度、局部轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)（表2，P＜0.05），而與年齡、性別無關(guān)。Annexin A7表達(dá)越高，傾向于分化越差、更容易發(fā)生局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差。

2.3 鼻咽癌CT表現(xiàn)與Annexin A7表達(dá)的關(guān)系

Annexin A7表達(dá)與CT征象中的侵及后鼻孔、侵及口咽部、顱底骨質(zhì)破壞及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（圖 2，表 3，P＜0.05），與腫塊單側(cè)或多側(cè)、是否有莖突旁軟組織腫塊無關(guān)，說明Annexin A7蛋白表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。

表3 鼻咽癌CT征象與Annexin A7表達(dá)關(guān)系

3 討論

CT征象是由腫瘤的組織病理學(xué)特性及生物學(xué)行為所決定的。而現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究使在蛋白質(zhì)水平和基因水平解釋腫瘤的組織病理學(xué)特征成為可能，從而有助于解釋腫瘤影像表現(xiàn)的多樣性和復(fù)雜性。因此，將影像醫(yī)學(xué)與分子生物學(xué)和分子病理學(xué)結(jié)合，研究腫瘤影像學(xué)表現(xiàn)的分子病理學(xué)基礎(chǔ)，將會(huì)提高對(duì)腫瘤影像學(xué)表現(xiàn)的認(rèn)識(shí)水平，從而為臨床診斷、選擇治療方案、判斷療效和評(píng)估預(yù)后等，提供更多、更有價(jià)值的信息[3-4]。目前，CT掃描是臨床上診斷NPC的主要手段，它不但能良好顯示鼻咽腔的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，還能顯示病變向鄰近組織結(jié)構(gòu)深入蔓延的范圍，以及顱底骨質(zhì)受侵和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況[5]。

圖2 鼻咽癌CT表現(xiàn)。圖2a：侵及后鼻孔；圖2b：侵及右側(cè)口咽部；圖2c：左側(cè)顱底骨質(zhì)破壞；圖2d：右側(cè)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Figure 2.CT of nasopharyngeal carcinoma.Figure 2a:invading posterior nares;Figure 2b:invading right pharynx oralis;Figure 2c:destruction of left basion;Figure 2d:right cervical lymph node metastasis.

膜聯(lián)蛋白（Annexins）是一種高度保守、廣泛表達(dá)、具有多種重要功能、分子量為28～33kD的鈣依賴磷脂結(jié)合蛋白超家族，與腫瘤細(xì)胞的增殖與分化、細(xì)胞骨架蛋白間的相互作用和維持細(xì)胞外基質(zhì)的完整性等方面有關(guān)[6-7]。Annexin A7是從牛腎上腺髓質(zhì)分離純化出的一種蛋白質(zhì)，由于它能使嗜鉻細(xì)胞顆粒聚集，故稱為會(huì)聯(lián)蛋白（synexin），與膜運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化和增殖有關(guān)[8-9]。

Annexin A7與腫瘤的關(guān)系密切，有研究發(fā)現(xiàn)，Annexin A7基因在轉(zhuǎn)移性前列腺癌及局部復(fù)發(fā)的激素不敏感的前列腺癌中表達(dá)顯著下調(diào)[10]。而在大多數(shù)良性前列腺組織、高度前列腺上皮內(nèi)瘤變以及前列腺癌T2和T3/4期中表達(dá)均上調(diào)；腫瘤組織中高水平的Annexin A7與乳腺癌強(qiáng)侵襲力、轉(zhuǎn)移力正相關(guān)，而與生存率間高度負(fù)相關(guān)[11]。轉(zhuǎn)移性乳腺癌中Annexin A7表達(dá)顯著上調(diào)；Annexin A7的表達(dá)與多形性惡性膠質(zhì)瘤生存期相關(guān)[12]；此外，Annexin A7高表達(dá)與許多種腫瘤的侵襲性相關(guān)[9]。以上研究表明，Annexin A7的表達(dá)水平和空間分布的變化與多種類型腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移進(jìn)程密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，Annexin A7表達(dá)在LMNPC中高于NPC，NPC中高于對(duì)照組，差異有顯著性意義，說明Annexin A7表達(dá)與NPC分化及轉(zhuǎn)移有關(guān)。Annexin A7表達(dá)還與組織分化程度、局部轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，而與年齡，性別無關(guān)。Annexin A7表達(dá)越高，傾向于分化越差、更容易發(fā)生局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后較差。Annexin A7可作為臨床上NPC預(yù)后及診斷的分子標(biāo)記物。

以免疫組化法研究Annexin A7蛋白表達(dá)與鼻咽癌CT表現(xiàn)之間的關(guān)系，國內(nèi)尚未見報(bào)道。Annexin A7表達(dá)與CT征象中的侵及后鼻孔、侵及口咽部、顱底骨質(zhì)破壞及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，說明Annexin A7蛋白表達(dá)增加時(shí)，NPC更易向深部軟組織間隙和顱底侵犯，其原因可能與Annexin A7調(diào)控細(xì)胞骨架和細(xì)胞外基質(zhì)的功能有關(guān)。

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