賈文韞 李寶蘭 岳文濤

作者單位:101149 北京,北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所細(xì)胞室(賈文韞,岳文濤);101149 北京, 北京胸科醫(yī)院綜合科(李寶蘭)(通訊作者:李寶蘭,E-mail: libaolan1109@yahoo.com.cn)

同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶2(homeodomaininteracting protein kinase -2, HIPK 2)是近二十年來發(fā)現(xiàn)的一種定位在細(xì)胞核內(nèi),調(diào)節(jié)多種細(xì)胞、組織和器官功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶.HIPK 2是潛在的腫瘤抑制因子和DNA損傷相關(guān)激酶,它通過磷酸化反應(yīng)作用于不同的下游靶點來激活凋亡進程.此外,HIPK 2還參與組織器官的形成、腫瘤的發(fā)生和發(fā)展.由于其作用廣泛,近年來受到廣大學(xué)者的關(guān)注.

1 HIPK 2的基本信息

上世紀(jì)90年代,Kim等[1]發(fā)現(xiàn)了一個由保守的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域和一個同源蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域組成的新的核蛋白激酶家族,由于該蛋白家族能夠增強同源轉(zhuǎn)錄蛋白的活性,特命名為HIPK.目前HIPK家族包括3個成員:HIPK 1、HIPK 2和HIPK 3.HIPK 2基因包含13個外顯子,大小約59X103bp,定位于7q33-7q34.HIPK 2高度保守,在小鼠定位于染色體6B.小鼠與人類之間HIPK 2氨基酸序列98%同源[2].HIPK 2在各類組織中表達(dá)各異.我們在實驗中也發(fā)現(xiàn)HIPK 2 mRNA在各肺癌細(xì)胞系中表達(dá)量不盡相同.

HIPK 2含1,189個氨基酸,屬于DYRK激酶家族,作為同源蛋白的一個轉(zhuǎn)錄輔助抑制物具有多個功能域:①和同源蛋白相互作用的結(jié)合域;② PEST(proline glutamic acid serine or threonine)序列,是位于細(xì)胞內(nèi)、半衰期不到2 h的富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸及蘇氨酸的區(qū)域,與蛋白的快速降解有關(guān),因此哺乳動物細(xì)胞中很難獲得該蛋白的信息[3];③輔助抑制域;④位于C-端的YH序列;⑤位于N-端的蛋白激酶活化域.定位于細(xì)胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)都具有的"核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)".

HIPK 2可以作用于多種功能性蛋白質(zhì),包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白、染色質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、跨膜蛋白以及小泛素相關(guān)修飾連接酶(small ubiquitin-related modif i er, SUMO)的E2成分[4,5].因此有學(xué)者[6]認(rèn)為HIPK 2是重要的調(diào)節(jié)因子.

2 HIPK 2的功能

2.1 HIPK 2對靶點的調(diào)節(jié) 當(dāng)細(xì)胞受到各種損傷時,HIPK 2會與腫瘤抑制因子p53形成復(fù)合物,磷酸化p53的Ser46,進而激活p53靶基因puma、bax和noxa等[7-11].已經(jīng)證實p53的Ser46在嚴(yán)重DNA損傷導(dǎo)致的凋亡中有重要作用[12].HIPK 2還能磷酸化小鼠p53 Ser58(Ser46的同源位點)引發(fā)凋亡[13].為了有效磷酸化p53,HIPK 2利用腫瘤抑制蛋白(promyelocytic leukemia, PML)作為輔助因子[14].HIPK 2和PML將p53整合為PML-NBs[15,16]而恢復(fù)p53活性[17-19].HIPK 2還能與乙酰轉(zhuǎn)移酶連接蛋白(CREB-binding protein, CBP)相互作用,在CBP幫助下,HIPK 2與p53定位于PML-NBs.在HIPK 2磷酸化p53 Ser46后,CBP乙?；痯53的Lys373和Lys382[20].p53 Lys373/Lys382乙?；谡T導(dǎo)凋亡和細(xì)胞老化中起著至關(guān)重要的作用[11].

除了PML及其相關(guān)的NBs,Wnt/β-catenin信號通道的支架蛋白Axin[21]、PML-NB片段Sp100[22]、Sp70、Daxx[23]和p53誘導(dǎo)因子p53DINP1/TP53INP1[24,25]都可以與p53和HIPK 2結(jié)合,作為HIPK 2磷酸化p53 Ser46的輔助因子[26].例如:HIPK 2會以將β-catenin的Ser33和Ser37殘基磷酸化和依賴蛋白酶體將β-catenin降解的方式,減弱Wnt/β-catenin信號通路,抑制體內(nèi)外細(xì)胞增殖,但是當(dāng)β-cateninatitsSer33和Ser37突變?yōu)楸彼釙r,HIPK 2將不能發(fā)揮上述作用[27].

目前有發(fā)現(xiàn)在急性前髓細(xì)胞性白血病中HIPK 2時常與類維生素A受體-α(RARα)融合.由于DNA損傷,HIPK 2磷酸化PML的Ser8和Ser38.盡管HIPK 2介導(dǎo)的PML磷酸化只發(fā)生在DNA損傷反應(yīng)的早期,但是具有致癌性的PML-RARα融合蛋白仍然受到強烈的遲發(fā)動力學(xué)效應(yīng),繼續(xù)磷酸化;而且DNA損傷或者HIPK 2表達(dá)可以穩(wěn)定PML和PML-RARα融合蛋白.N末端磷酸化部位導(dǎo)致DNA損傷引發(fā)的PML泛素化,而且它是PML與HIPK 2相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的必需條件[28].

另外,在幾種上皮腫瘤中增強整合素α6和整合素β4的表達(dá)能促進腫瘤發(fā)展,但是具體機制不清楚.敲除HIPK 2能激活整合素β4轉(zhuǎn)錄,進而明顯增加整合素β4依賴性促分裂原活化蛋白和AKT磷酸化.在p53表達(dá)的細(xì)胞(野生型wtp53細(xì)胞系)中保證HIPK 2水平就能抑制整合素β4的表達(dá),缺失或者突變的p53細(xì)胞中卻不會出現(xiàn)這種現(xiàn)象.這說明HIPK 2通過p53起作用.與體外實驗相符的是表達(dá)p53的野生型人乳腺癌細(xì)胞中整合素β4過表達(dá)與HIPK 2活性受抑制有極其密切的關(guān)系.當(dāng)消除HIPK 2和p53的功能后,p53家族的TAp63和TAp73能強烈激活整合素β4轉(zhuǎn)錄.總之,p53功能缺失有助于輔激酶蛋白與p53家族中TA成員結(jié)合,繼而允許整合素β4轉(zhuǎn)錄[29].

HIPK 2還表現(xiàn)出許多與p53無關(guān)的作用功能和方式.人類轉(zhuǎn)錄因子ZBTB4是HIPK 2的新靶點,兩蛋白可以在體外相互作用,在體內(nèi)也因局部化而相互結(jié)合.HIPK 2可以磷酸化ZBTB4的幾個保守的殘基,即795、797和983位蘇氨酸.過表達(dá)HIPK 2可使ZBTB4降解,而過表達(dá)激酶缺陷型HIPK 2突變體則沒有這種作用.HIPK 2的化學(xué)活性還能減少細(xì)胞中ZBTB4的數(shù)量,反之用藥物或者RNA干擾可以增加ZBTB4水平.上述HIPK對ZBTB4負(fù)性調(diào)節(jié)都是在正常培養(yǎng)條件下進行的.另外,ZBTB4的降解也隨著DNA損傷而增加.Yamada等[30]發(fā)現(xiàn)ZBTB4可以抑制p21轉(zhuǎn)錄、對抗損傷細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯,引導(dǎo)其凋亡.因此HIPK 2對p21的活化可能有兩條途徑,刺激活化劑p53,同時抑制抑制劑ZBTB4.重要的是HIPK 2在作用過程中并沒有磷酸化p53.

Rett綜合癥是一種神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重失?，F(xiàn)象.甲基化的CG序列結(jié)合蛋白2(MeCP2)突變與Rett綜合癥和其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān),它通過增加各種輔阻遏物而抑制轉(zhuǎn)錄.最近發(fā)現(xiàn),大腦中MeCP2發(fā)生Ser80、Ser229和Ser421磷酸化,調(diào)節(jié)MeCP2沉默活性.Bracaglia等首次鑒定出HIPK 2作為激酶可以在體內(nèi)外與MeCP2結(jié)合并磷酸化其Ser80,而且HIPK 2必須與MeCP2的DNA結(jié)合才能磷酸化其Ser80,誘導(dǎo)凋亡.HIPK 2基因缺失小鼠的神經(jīng)缺陷表明了其對正常大腦功能維持的重要作用[31].

在p53缺失的細(xì)胞內(nèi),HIPK 2一樣能夠調(diào)控DNA損傷細(xì)胞的凋亡.HIPK 2將C末端結(jié)合蛋白CtBP Ser422磷酸化,使CtBP在蛋白酶體降解.而且,在p53缺失的肝癌細(xì)胞系內(nèi),p53通過激活JNK信號通路調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)介導(dǎo)凋亡[32].在紫外照射損傷時,JNK也能調(diào)節(jié)CtBP Ser422磷酸化及凋亡,這說明HIPK 2既能直接磷酸化CtBP,又能間接通過JNK協(xié)同取得相同的結(jié)果[32,33].

2.2 p53及其它因子對HIPK 2的調(diào)節(jié)作用 HIPK 2的功能反過來也會受到p53的調(diào)節(jié),而且p53同時具有激活和抑制HIPK 2的能力.p53通過caspase途徑作用于HIPK 2的916和977位天冬氨酸殘基[34,35].更令人驚奇的是HIPK 2的生成過程中需要p53的靶基因caspase-6[36].因此,p53可以利用其caspase通路反向調(diào)節(jié)HIPK 2的凋亡活性.

有資料[37]顯示p53介導(dǎo)的E3泛素連接酶MDM2/HDM2可能是HIPK 2的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,在DNA出現(xiàn)損傷時,它可以泛素化HIPK 2,并將其降解.

酵母雙雜交試驗證實WD40/SOCSbox蛋白(WSB)作為E3泛素連接酶,可以與HIPK 2相互作用.過表達(dá)WSB-1可以使其利用C末端降解HIPK 2.利用shRNA敲除內(nèi)源WSB-1能增加內(nèi)源HIPK 2的穩(wěn)定性并使其聚集.在WSB-1中,主要是WD40重復(fù)序列和SOCS盒與HIPK 2結(jié)合并降解,而且WSB-1在體內(nèi)外都能泛素化HIPK 2[38].含保守序列WD-40蛋白的人類花色素苷調(diào)節(jié)劑基因11(Han11)可以干擾HIPK 2,體外Han11可直接與HIPK 2結(jié)合,通過HIPK 2調(diào)節(jié)激酶信號系統(tǒng)[39].

3 HIPK 2與肺癌

p53對MDM2的負(fù)性調(diào)節(jié)非常敏感,MDM2通過自動調(diào)節(jié)通路可以明顯抑制p53活性.由于應(yīng)激,p53發(fā)生翻譯后修飾,使其逃脫MDM2的控制,蓄積而激活.最近在肺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)[4],在MDM2參與下HIPK 2對p53有活化作用.DNA損傷后,HIPK 2連接并磷酸化p53,使其轉(zhuǎn)錄、凋亡,克服MDM2抑制.細(xì)胞發(fā)生DNA損傷后,可以通過阻止p53出核轉(zhuǎn)運和MDM 2調(diào)節(jié)的蛋白化調(diào)節(jié)p53介導(dǎo)的凋亡.這就進一步闡釋了HIPK 2/p53通路促進凋亡和抑制腫瘤形成的機制.

基因敲除小鼠胚胎成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄輔抑制子羧基末端凝結(jié)蛋白CtBP可以上調(diào)包括凋亡在內(nèi)的多種基因.因此,有人預(yù)言可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)CTBP的水平來調(diào)節(jié)凋亡能力.如前所述,HIPK 2就是這樣一個因子,而且證實HIPK 2激活可以使CtBP Ser422磷酸化而降解.研究發(fā)現(xiàn)c-Jun氨基末端激酶1(c-Jun NH2-terminal kinase 1)活化也可以磷酸化CtBP Ser422并降解,使與p53無關(guān)的人肺癌細(xì)胞系凋亡.JNK1以前曾被認(rèn)為與紫外線介導(dǎo)的凋亡有關(guān),表達(dá)MKK7-JNK1或者紫外照射會通過蛋白酶體介導(dǎo)的通路減少CTBP水平 .這一作用會因為JNK1缺失而受阻.此外,使用順鉑持續(xù)激活JNK1通路產(chǎn)生了類似的CTBP降解現(xiàn)象.這一結(jié)果為p53缺失型腫瘤提供了新的化療靶點[35].

當(dāng)核酸毒性藥物使DNA受損時,HIPK 2能使腫瘤抑制因子p53atSer46磷酸化,進而啟動凋亡過程.HIPK 2在某些細(xì)胞內(nèi)被以蛋白酶體依賴的和泛素連接酶Siah1部分依賴的方式泛素化降解而失活[40].HIPK 2還是低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)的轉(zhuǎn)錄輔抑制子,可以抑制腫瘤血管生成和對抗耐藥的產(chǎn)生.HIPK 2在腫瘤中由于缺氧等多種機制而擺脫調(diào)控.研究人員想通過恢復(fù)HIPK 2功能和抑制HIF-1α來研究缺氧問題,以此證實HIPK 2和p53與缺氧導(dǎo)致的耐藥有關(guān). 因為增加HIF-1α表達(dá)或者以藥物抑制p53功能就會損傷HIPK 2的功能,于是作者用低氧或者鈷元素處理結(jié)腸和肺癌細(xì)胞系.鈷能抑制HIPK 2對HIF-1α啟動子的募集反應(yīng),低氧使p53靶點MDM2表達(dá),并下調(diào)HIPK 2,當(dāng)對MDM2進行RNA干擾后,恢復(fù)了用藥時的HIPK 2/p53 Ser46磷酸化反應(yīng)[41].另外,雖然低氧可以不可逆的抑制HIPK 2,但是補充鋅可以重新激活缺氧抑制的HIPK 2,使得HIF-1通路受到抑制,恢復(fù)p53 Ser46凋亡活性[42]..

4 HIPK 2的初步應(yīng)用

如前所述,WSB-1對泛素化和降解HIPK 2有重要作用,但是當(dāng)應(yīng)用阿霉素和順鉑等DNA損傷藥物時,該作用會被完全抑制.這就解釋了一些腫瘤的耐藥機制,并提供了解決問題的可能方向[38].

鑒于HIPK 2/p53 Ser46通路的重要作用,有學(xué)者分別比較了順鉑敏感和抗藥的卵巢癌細(xì)胞系2008和2008C13內(nèi)藥物引發(fā)的HIPK 2/p53 Ser46凋亡通路.藥物(阿霉素和順鉑)不同,兩細(xì)胞系內(nèi)HIPK 2的表達(dá)也不同.在耐藥細(xì)胞系內(nèi)沒檢測到p53 Ser46凋亡通路.盡管2008C13細(xì)胞系耐受順鉑,但是對阿霉素介導(dǎo)的HIPK 2/p53 Ser46凋亡通路很敏感,而且敲除HIPK 2后,上述作用就會受到抑制.添加外源HIPK 2和轉(zhuǎn)入p53 Ser46的靶基因AIP1能誘導(dǎo)耐鉑細(xì)胞的凋亡.這些結(jié)果表明鉑類耐藥存在不同的藥物激活通路調(diào)節(jié)HIPK 2和HIPK 2/p53 Ser46,外源性的HIPK 2可能成為治療耐藥野生型p53卵巢癌的新療法[43].

很長時間以來人們也在尋找無遺傳毒性的特異性p53復(fù)活劑.MDM2對抗劑Nutlin-3和RITA是兩種能夠誘導(dǎo)有絲分裂停滯、臨床學(xué)者所期盼的具有凋亡效應(yīng)的藥物.在經(jīng)Nutlin-3處理的細(xì)胞系內(nèi),隨著p53復(fù)活,MDM2將p53凋亡前活化劑HIPK 2降解,但是在RITA處理的細(xì)胞系內(nèi),短暫降低MDM2水平又會將HIPK 2激活.這表明MDM2對HIPK 2的調(diào)節(jié)對于決定細(xì)胞是有絲分裂停滯還是凋亡有很大作用,此外提示了欲利用MDM2對抗劑復(fù)活p53功能,可以將目光投在MDM2的靶點,而不是僅僅考慮p53本身[44].

基于鈷和低氧對HIPK 2的調(diào)節(jié)作用機理,在低氧環(huán)境細(xì)胞培養(yǎng)基中添加鋅能增強

HIPK 2蛋白的穩(wěn)定性和在細(xì)胞核內(nèi)的聚集,使HIPK 2重新與HIF-1α啟動子結(jié)合,抑制MDR1、Bc12和VEGF基因轉(zhuǎn)錄,激活p53凋亡對藥物的反應(yīng).聯(lián)合應(yīng)用鋅和ADR可以通過抑制HIF-1α通路和上調(diào)p53凋亡靶基因而明顯抑制體內(nèi)腫瘤生長[41,42].這對抗腫瘤新藥的研發(fā)或者原有藥品的改造和利用具有很好的提示作用.

由于使用阿霉素化療所致的缺氧腫瘤細(xì)胞內(nèi),p53 Ser46磷酸化受損,腫瘤產(chǎn)生耐藥,但是,應(yīng)用蛋白酶體抑制劑能恢復(fù)缺氧肝細(xì)胞內(nèi)HIPK 2的表達(dá)、p53 Ser46磷酸化和caspase活性.因此,蛋白酶體抑制劑可作為潛在方法,使缺氧腫瘤細(xì)胞對治療仍然敏感[40].

5 問題與展望

盡管目前人們對HIPK 2調(diào)節(jié)機制和信號通路有了更加深入的了解,但是仍有許多問題有待解決,如由于HIPK 2廣泛的降調(diào)作用,人們普遍認(rèn)為HIPK 2是一個腫瘤抑制基因,而且HIPK 2在乳癌、甲狀腺癌以及血液學(xué)疾病中表達(dá)下調(diào),但是在結(jié)腸癌和宮頸癌中表達(dá)比良性病變和正常組織中高[45].這些差別的原因何在?低表達(dá)的原因有是否相同?是基于機制的不同,還是由于技術(shù)層面原因?在這一過程中是否出現(xiàn)了HIPK 2的突變,突變后作用如何?能否為相關(guān)腫瘤提供化學(xué)或基因治療的現(xiàn)希望?這些問題都需要廣大學(xué)者進一步深入研究.