穆艷娥，王拴福，姬青云，柴生武，鄧?yán)麗郏瑥垨|紅，石維山

（山西省薯類脫毒研究中心，山西 太原 030006）

利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行馬鈴薯脫毒試管苗快繁時(shí)，常常會(huì)出現(xiàn)不同程度的污染，在高溫高濕的情況下污染更為嚴(yán)重，導(dǎo)致組織培養(yǎng)工作的失敗，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，在組織培養(yǎng)過(guò)程中，控制污染是非常重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。本文主要從污染的主要病原及癥狀、常見的污染及產(chǎn)生原因方面進(jìn)行了闡述，并提出了相應(yīng)的防治措施。

1 主要病原及癥狀

污染產(chǎn)生的病原主要有細(xì)菌和真菌兩類。細(xì)菌污染的癥狀出現(xiàn)較快，一般在接種1～2天即可出現(xiàn)，表現(xiàn)癥狀為在培養(yǎng)基或材料表面常出現(xiàn)黃色、粉液狀半透明膜狀。真菌污染的癥狀出現(xiàn)比細(xì)菌慢，一般在接種5～10天才有所表現(xiàn)，表現(xiàn)癥狀為初期如針狀的霧斑，以后長(zhǎng)出菌絲，繼而很快出現(xiàn)黑、白、黃、綠等色的孢子。

2 常見污染及產(chǎn)生的原因

2.1 細(xì)菌污染

主要是由于材料本身或培養(yǎng)基滅菌不徹底造成的。接種前如果培養(yǎng)瓶清洗的不干凈而滅菌又不徹底，耐高溫的雜菌不能被殺死，接種前培養(yǎng)基就會(huì)被細(xì)菌污染；接種時(shí)如果工作人員操作不規(guī)范，使用未消毒或消毒不徹底的器械或者是用手接觸器皿邊緣或材料，也可導(dǎo)致接種后外植體周圍出現(xiàn)細(xì)菌污染。

2.2 真菌污染

接種前培養(yǎng)基就出現(xiàn)了真菌污染，其原因多數(shù)是由于封口不嚴(yán)或培養(yǎng)基存放的環(huán)境中孢子濃度過(guò)大造成的；其次，如果母液儲(chǔ)備液被污染，也能引起培養(yǎng)基表面大量真菌污染。接種后初期，培養(yǎng)基表面出現(xiàn)了真菌污染且位置不定，其原因可能是由于超凈工作臺(tái)的濾布不潔凈或接種室孢子濃度過(guò)大造成的。如果接種后較長(zhǎng)時(shí)間出現(xiàn)了真菌污染，主要原因是培養(yǎng)材料攜帶了內(nèi)生菌或封口不嚴(yán)造成的。接種后外植體周圍出現(xiàn)真菌污染，主要原因是由于苗源瓶中的苗源已被雜菌感染，但由于感染初期菌源太小，工作人員肉眼不易發(fā)現(xiàn)，接種到培養(yǎng)基瓶上從而引起感染；另外，如果苗源瓶表面消毒不徹底，也可將菌帶入接種瓶?jī)?nèi)而引起感染。

3 防治措施

利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行馬鈴薯脫毒試管苗快繁是一項(xiàng)無(wú)菌操作技術(shù)，不僅要求工作人員在操作過(guò)程中遵守?zé)o菌操作規(guī)程，而且培養(yǎng)室、工作人員的衣物以及操作過(guò)程中所用的一切用具、培養(yǎng)基、材料等都要求無(wú)菌，稍有疏忽就會(huì)導(dǎo)致組織培養(yǎng)工作的失敗，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

3.1 接種前消滅污染菌源

3.1.1 消滅容器雜菌，保證容器清潔。洗凈的玻璃容器應(yīng)發(fā)亮，內(nèi)外壁水膜均勻，瓶壁不掛水珠。瓶蓋也要認(rèn)真涮洗，清洗干凈后晾干與瓶子一起存放備用。取拿容器時(shí)盡量不接觸內(nèi)壁。

3.1.2 消滅水質(zhì)雜菌。培養(yǎng)基母液最好用蒸餾水配置，也可用純凈、無(wú)色透明、無(wú)懸浮物的食用水制作，以減少菌源和避免雜菌滋生蔓延。配置好的母液要置于4℃冰箱中保存。

3.1.3 培養(yǎng)基滅菌。培養(yǎng)基裝入高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌時(shí),升溫初期打開放汽閥將冷空氣充分放盡，待鍋內(nèi)溫度升至105℃時(shí)關(guān)閉放汽閥?？諝馀挪槐M易造成高壓低溫現(xiàn)象，達(dá)不到滅菌的目的。升溫至120～121℃穩(wěn)定滅菌20～25 min，但不宜超過(guò)30 min，否則易引起培養(yǎng)基凝固不良。為了增強(qiáng)滅菌效果,可以在培養(yǎng)基中加適宜的抗生素。

3.1.4 選擇無(wú)污染培養(yǎng)基。把高溫高壓滅菌的培養(yǎng)基置于無(wú)菌室內(nèi)保存，在室溫下放置2～3天，檢查培養(yǎng)基，剔除滅菌不徹底的培養(yǎng)基，選用干凈無(wú)菌的培養(yǎng)基。

3.1.5 接種室消毒。接種前，首先對(duì)超凈工作臺(tái)進(jìn)行徹底消毒。用75%的酒精棉擦拭超凈工作臺(tái)，然后打開紫外燈，照射20 min后關(guān)閉紫外燈，開啟風(fēng)機(jī)，用無(wú)菌風(fēng)吹10 min后方可開始工作。定期用紫外線燈光對(duì)接種室照射消毒 20 min，以達(dá)到殺滅接種室內(nèi)菌源的目的。

3.1.6 工作人員消毒。工作人員使用的工作服、帽子、口罩等要保持干凈，并定期進(jìn)行消毒。經(jīng)常檢查消毒鍋的滅菌質(zhì)量，若發(fā)現(xiàn)問(wèn)題要立即檢修。

3.2 接種時(shí)嚴(yán)格無(wú)菌操作

3.2.1 仔細(xì)觀察待轉(zhuǎn)基礎(chǔ)苗，確認(rèn)無(wú)污染才能取用。用酒精棉(或酒精布)擦拭待轉(zhuǎn)瓶苗的外壁，消除附著在瓶外壁上的雜菌后轉(zhuǎn)入無(wú)菌室。

3.2.2 工作人員消毒。工作人員進(jìn)入無(wú)菌室時(shí)要洗手、換衣，并戴帽子和口罩，進(jìn)入后首先要用75%的酒精仔細(xì)擦手，然后將工作臺(tái)面及臺(tái)壁用75%的酒精棉(或酒精布)擦拭消毒。

3.2.3 接種工具消毒。所用的接種工具如鑷子、剪刀、支架都要從外到內(nèi)、從正到反在酒精燈的外焰上來(lái)回消毒冷卻后待用。接種時(shí)瓶口靠近酒精燈火焰，每接一瓶所用工具消毒一次。

3.2.4 接種后的培養(yǎng)基瓶口必須封嚴(yán),以減少瓶?jī)?nèi)與室內(nèi)空氣的對(duì)流，控制氣流傳菌。

3.2.5 超凈工作臺(tái)上盡量少放瓶子，接種瓶、苗源瓶

(基礎(chǔ)苗)不能堆放過(guò)滿，以保證氣流暢通。

3.3 內(nèi)生細(xì)菌的防治

內(nèi)生細(xì)菌在外植體的初級(jí)培養(yǎng)中不易被發(fā)現(xiàn)，隨著繼代次數(shù)的增加，菌量慢慢累積發(fā)展才在培養(yǎng)基上顯現(xiàn)出來(lái)。一般可通過(guò)在培養(yǎng)基中添加抗生素或抑菌劑來(lái)防止和減少細(xì)菌等內(nèi)生菌的污染。在使用抗生素時(shí)需要注意以下幾點(diǎn):（1）對(duì)癥下藥；（2）確定最適抑制濃度；（3）確定抗生素在培養(yǎng)基上的作用和穩(wěn)定性；（4）確定抗生素不會(huì)對(duì)植物造成傷害或突變。例如，可在培養(yǎng)基加入1 mL/L的慶大霉素。

3.4 接種后嚴(yán)格管理

3.4.1 嚴(yán)禁非工作人員出入，工作人員入內(nèi)時(shí)必須穿戴清潔工作服并套鞋套(或?qū)Ｓ猛闲?，以控制外界雜菌傳入無(wú)菌區(qū)。

3.4.2 培養(yǎng)室內(nèi)光照控制在2000～3000 Lx，每天20～25℃光照16 h。每隔一周用甲醛熏蒸消毒一次，具體做法是將50 mL甲醛倒入15 g左右高錳酸鉀中,密閉接種室門窗24 h，可殺死空氣中的污染菌源。

3.4.3 及時(shí)挑出培養(yǎng)室被污染的瓶苗，然后將污染苗用高壓鍋滅菌后。集中遠(yuǎn)距離深埋，徹底消滅再侵染源。當(dāng)特別珍貴、稀少的資源被污染時(shí),如果污染程度較輕，可以對(duì)其進(jìn)行挽救，方法是：先將瓶苗移出培養(yǎng)室,然后用酒精棉將污染處蓋住,用無(wú)菌操作剪將未污染的部分剪下來(lái)，先用75%的酒精沖洗30 s,再用無(wú)菌水沖洗2次,容器表面消毒后移入超凈工作臺(tái),再用0.1%的Hg2CL2浸泡4～10 min,最后用無(wú)菌水沖洗3～5次后轉(zhuǎn)接到新培養(yǎng)基上。處理后的材料要與其他脫毒苗分開放置,觀察一段時(shí)間確定無(wú)污染再放回原處保存。