肖佳佳，張鳳鳳，熊顯榮，張涌

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100

c-myc基因是細(xì)胞進(jìn)化過程中高度保守的基因之一。c-myc基因最初是從雞病毒v-myc基因的同源物中分離出來的，由3個(gè)外顯子及2個(gè)內(nèi)含子組成，第 1個(gè)外顯子不編碼，只起調(diào)節(jié)作用，只有外顯子2和3與v-myc相對(duì)應(yīng)。在不同動(dòng)物中，c-myc基因的第 1外顯子差異較大，其他則高度保守。c-myc基因編碼的相關(guān)蛋白，是一個(gè)由439個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分為C端 (C-terminal)、中間部分和N端 (N-terminal)。C端140個(gè)氨基酸是DNA結(jié)合和形成雜合體的結(jié)構(gòu)域，包含堿性螺旋-環(huán)-螺旋以及亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu) (Basic helix-loop-leucine zipper，BHLH-LZ) 及與Max的結(jié)合區(qū)。N端143個(gè)氨基酸是轉(zhuǎn)錄激活功能域，包含2個(gè)myc家族特有的高保守序列。中間部分包含1個(gè)非特異性DNA結(jié)合區(qū)和1個(gè)核定位信號(hào) (Nuclear localiaztino singal，NLS)，前者的功能是協(xié)助堿性區(qū)尋找DNA特異結(jié)合位點(diǎn)；后者是 c-myc蛋白進(jìn)入核內(nèi)所必需的結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)將c-myc蛋白轉(zhuǎn)入并定位于核內(nèi)[1-3]。

2006年，Yamanaka等[4]首次開創(chuàng)性地利用反轉(zhuǎn)錄病毒分別將4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子 (Oct-3/4、Sox2、KLF4和 c-Myc) 一起導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和成體成纖維細(xì)胞，并都成功得到小鼠iPS細(xì)胞。2007年，Takahashi等[5]又用同樣的轉(zhuǎn)錄因子組合導(dǎo)入成人的成纖維細(xì)胞，得到人的iPS細(xì)胞。這些細(xì)胞與ES細(xì)胞在形態(tài)、增殖、表面抗原、基因表達(dá)和體內(nèi)外分化等方面基本一致。2008年，Dubois等[6]的研究證明，造血干細(xì)胞的功能特別依賴c-Myc因子。胚胎干細(xì)胞的自我更新能力有賴于白血病抑制因子 LIF的存在。LIF結(jié)合其相識(shí)受體后，活化轉(zhuǎn)錄因子STAT3，后者激活 c-myc的表達(dá)。STAT3或 c-myc突變體等位基因 (T58A) 的結(jié)構(gòu)性表達(dá)，即使移除LIF，也能維持ES細(xì)胞的自我更新和多能性狀態(tài)；反之，抑制c-myc即使存在LIF也誘發(fā)ES細(xì)胞分化，這證明c-myc對(duì)于抑制ES細(xì)胞分化并保持其自我更新的能力具有關(guān)鍵性作用[7]。這些研究表明，c-myc基因在誘導(dǎo)成體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)?iPS細(xì)胞，并抑制其分化，使其維持自我更新和多能性狀態(tài)方面起著重要作用。

本研究擬從胎牛原始生殖嵴獲得 c-myc基因，構(gòu)建 c-myc基因真核表達(dá)質(zhì)粒，并在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞，并觀察記錄其表達(dá)情況，為進(jìn)一步誘導(dǎo)牛的iPS提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

40日齡的秦川牛胎兒由楊凌科元克隆股份有限公司提供。載體pIRES2-AcGFP1-Nuc、牛皮膚成纖維細(xì)胞，菌株 JM109均為本實(shí)驗(yàn)室保存。LA Taq酶、pMD19-T Vector、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司，DNA凝膠回收試劑盒購自AXGEN公司；各種限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工生物技術(shù)有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒購自康為公司；多種 DNA marker購自Transgen公司。

細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：基本培養(yǎng)基 (DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、青霉素、鏈霉素均購自Gibico公司；Trizol試劑購自 Invitrogen公司；FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑(Roche) 及其他試劑購自 Sigma等公司。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；基因測(cè)序工作由華大基因 (北京) 公司完成。

1.2 方法

1.2.1 牛c-myc基因的克隆

根據(jù)已發(fā)表牛c-myc基因mRNA序列 (GenBank Accession No. BC113343)，設(shè)計(jì)合成1對(duì)引物，上游引物 Mycs：5′-TCGGCTAGC ATGCCCCTCAAC GTCAG-3′ (下劃線處為NheⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物Myca：5′-GCAGAATTC GGCGCAAGAGTTCCGTAT C-3′ (下劃線處為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

采集40日齡牛胎兒原始生殖嵴，用Trizol試劑從原始生殖細(xì)胞 (Primodial genital cells，PGC) 中提取總mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以Mycs和Myca為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。預(yù)期PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)為1 335 bp。

1.2.2 pMD19-T載體克隆與測(cè)序

PCR產(chǎn)物經(jīng)快速回收，回收產(chǎn)物 (目的片段)和pMD19-T載體在T4 DNA連接酶作用下于16 ℃連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌 JM109，菌液與IPTG和X-gal按比例混勻后涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的 LB平皿上篩選，挑取大小均勻的白斑搖菌，按照質(zhì)粒抽提試劑盒說明書小量提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ與NheⅠ雙酶切鑒定，將獲得的陽性克隆質(zhì)粒 (命名為 pMD19-T-c-myc，簡(jiǎn)寫為 pTM) 送華大基因 (北京) 公司測(cè)序。用NCBI在線工具Blast對(duì)所克隆c-myc基因序列與GenBank中的序列進(jìn)行同源性比較分析。

1.2.3 pRM的構(gòu)建與鑒定

圖1 pIRES2-AcGFP1-Nuc質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Structure of the recombinant plasmid pIRES2-AcGFP1-Nuc.

將載體質(zhì)粒pIRES2-AcGFP1-Nuc (圖1) 和測(cè)序正確的質(zhì)粒pTM用內(nèi)切酶NheⅠ和EcoRⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，回收載體質(zhì)粒 pIRES2-AcGFP1-Nuc和c-myc基因的DNA片段，T4 DNA連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109，經(jīng)含卡那霉素 (60 μg/mL) 的LB平皿培養(yǎng)篩選克隆、提取質(zhì)粒后，用NheⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，再送華大基因 (北京) 公司測(cè)序。測(cè)序正確的菌株于37 ℃擴(kuò)增搖菌 100 mL，提取重組表達(dá)載體陽性質(zhì)粒(pIRES2-AcGFP1-Nuc-c-Myc，簡(jiǎn)寫為 pRM)，測(cè)定其核酸濃度，備用。

1.2.4 重組質(zhì)粒pRM導(dǎo)入牛皮膚成纖維細(xì)胞

轉(zhuǎn)染前2 d，將牛皮膚成纖維細(xì)胞接種至6 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液為含10%新生牛血清，不含青霉素、鏈霉素的高糖DMEM。當(dāng)細(xì)胞匯片達(dá)80%~90%時(shí)，嚴(yán)格按照 FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑說明書的方法將重組質(zhì)粒pRM導(dǎo)入牛皮膚成纖維細(xì)胞。轉(zhuǎn)染12 h后換為含 10%新生牛血清，青霉素、鏈霉素各100 U/mL的高糖DMEM。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)牛c-myc基因表達(dá)

轉(zhuǎn)染12 h后熒光顯微鏡觀察上述轉(zhuǎn)染的牛皮膚成纖維細(xì)胞，24 h后用Trizol試劑提取總RNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，以此為模板，用下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增：Forward (myc)：5′-ATGCCCCTCAA CGTCAG-3′，Reverse (myc)：5′-GGCGCAAGAGTTC CGTATC-3′。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)牛皮膚成纖維細(xì)胞c-myc蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染24 h后，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液 (150 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)，5 mmol/L EDTA，1% Triton X-100，1 mmol/L PMSF)，冰浴上裂解細(xì)胞 30 min，15 000 r/min 離心10 min，收獲上清液。將上述細(xì)胞裂解后得到的上清加入 5× SDS-PAGE上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min。13 000×g 離心10 min，取12 μL上清點(diǎn)樣，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳。以濕轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，再加入用 TBST配制的5%脫脂奶粉，室溫平穩(wěn)搖動(dòng)2 h。用TBST洗膜3次，每次10 min。加入一抗 (按1∶1 000比例用 TBST稀釋，液體覆蓋膜的全部)，4 ℃放置12 h以上。棄一抗，用TBST洗膜10 min重復(fù)4次。加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗 (按 1∶2 000比例用TBST稀釋)，室溫平穩(wěn)搖動(dòng)2 h。棄二抗，用TBST洗膜10 min重復(fù)4次。洗膜后用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，保鮮膜包裹硝酸纖維素膜，固定在暗盒內(nèi)，壓X光膠片，曝光，顯影，定影。用預(yù)染蛋白marker判定目的蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 牛c-myc基因的克隆與測(cè)序

用40日齡牛胎兒PGC克隆牛c-myc基因編碼序列，預(yù)期PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)為1 335 bp。采用擴(kuò)增復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)模板專用的LA Taq聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到預(yù)期長(zhǎng)度的擴(kuò)增片段。所得擴(kuò)增片段測(cè)序后，與已發(fā)表的牛 c-myc基因序列 (GenBank Accession No. BC113343) 進(jìn)行同源性比較分析，核苷酸序列沒有發(fā)生突變，證明所克隆片段為牛c-myc基因編碼序列。

2.2 真核表達(dá)載體的構(gòu)建

pTM和pIRES2-AcGFP1-Nuc 載體分別經(jīng)過雙酶切，膠回收，連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)菌構(gòu)建的重組質(zhì)粒再經(jīng)NheⅠ和EcoRⅠ雙酶切和1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得大小為1 329 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果相符 (圖2)。鑒定正確的質(zhì)粒命名為pRM。

2.3 牛c-myc在皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)

重組質(zhì)粒pRM轉(zhuǎn)染12 h后，在熒光顯微鏡下觀測(cè) GFP的表達(dá)情況 (圖 3)。結(jié)果表明質(zhì)粒 pRM已轉(zhuǎn)染到牛成纖維細(xì)胞內(nèi)并表達(dá)。轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞用Trizol試劑提取總RNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，以此為模板用引物 Forward (myc) 和Reverse (myc) 擴(kuò)增后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得了大小為1 317 bp的目的條帶 (圖4)，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖2 pRM質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 2 Identification of pRM by enzyme digestion. M: trans15K DNA marker; 1: intact pRM; 2: pRM digested with Nhe I and EcoR I.

圖3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞Fig. 3 The fibroblasts transfected with pRM. (A) The cells transfected with pRM under microscope (100×). (B) The cells transfected with pRM under fluorescent microscope (100×).

圖4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中c-myc基因的表達(dá)檢測(cè)Fig. 4 Expression detection of c-myc gene in pRM-transfected fibroblast cells. M: DL2000 DNA marker; 1: pRM-transfected fibroblast cells.

2.4 c-myc蛋白在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)

將轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用胰酶消化，預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液，冰浴上裂解細(xì)胞30 min，經(jīng)離心收獲上清，進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，抗體孵育，曝光，顯影，定影。結(jié)果如圖 5所示：轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞樣品出現(xiàn)了約49 kDa的特異性條帶，陰性對(duì)照組則未出現(xiàn)此反應(yīng)條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖5 c-myc蛋白的Western blotting檢測(cè)Fig. 5 Western blotting detection of c-Myc protein. M: prestained protein marker; 1: pRM-transfected fibroblast cells; 2: non-transfected fibroblast cells.

3 討論

由于牛 c-myc基因編碼序列 G、C含量達(dá)到59%，所以本研究采用了能夠很好地?cái)U(kuò)增復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)模板的LA Taq聚合酶，并以胎牛原始生殖嵴為材料提取總RNA，再以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的產(chǎn)物與已發(fā)表的牛c-myc基因序列 (GenBank Accesion No. BC113343) 進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示得到的產(chǎn)物并未發(fā)生位點(diǎn)突變。本研究利用牛 c-myc基因的編碼序列成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pRM。該載體在轉(zhuǎn)染牛皮膚成纖維細(xì)胞之后能正確表達(dá)c-Myc蛋白。

c-myc對(duì)細(xì)胞具有雙重作用，既可刺激細(xì)胞增殖，也可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。在細(xì)胞增殖的過程中，c-myc可使細(xì)胞由G0期進(jìn)入G1期，從而由靜止期向DNA的合成轉(zhuǎn)變。c-myc也能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其細(xì)胞凋亡作用依賴于 c-myc蛋白的表達(dá)水平[9]。本研究在操作過程中發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒 pRM 轉(zhuǎn)染牛皮膚成纖維細(xì)胞48 h之后部分陽性細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡趨勢(shì)，可能是因?yàn)樵谄渌蜃硬蛔愕那闆r下c-myc的異常表達(dá)導(dǎo)致了皮膚成纖維細(xì)胞的衰老和凋亡。外源性c-myc轉(zhuǎn)錄因子與其他因子組合，可以將哺乳動(dòng)物體細(xì)胞誘導(dǎo)為 iPS細(xì)胞，但到目前為止，將體細(xì)胞核重編程為iPS細(xì)胞的分子機(jī)理以及c-myc轉(zhuǎn)錄因子在此過程中起何具體作用仍不是很清楚。2007年，Yamanaka[10]提出了一個(gè)關(guān)于iPS細(xì)胞誘導(dǎo)過程中外源轉(zhuǎn)錄因子如何起作用的模型，他認(rèn)為Oct4促使細(xì)胞向ES細(xì)胞方向發(fā)展，在Sox2的共同作用下，調(diào)控細(xì)胞一系列基因的表達(dá)，使細(xì)胞獲得多能性狀態(tài)，c-myc起到打開染色體結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，但同時(shí)c-myc還導(dǎo)致細(xì)胞的衰老和凋亡，而Klf4則阻斷了細(xì)胞衰老和凋亡的過程。近年來，在 iPS細(xì)胞的研究過程中，人們?cè)鴩L試除了經(jīng)典的四因子組合之外，用減少某些因子的方法，看能否誘導(dǎo)得到iPS細(xì)胞。Huangfu等[11]僅用Oct4、Sox2兩個(gè)因子和一種組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶抑制物——丙戊酸(Valproic acid，VPA) 成功得到iPS細(xì)胞。Kim等[12]用Oct4分別與Klf4或c-Myc組合，以二因子成功誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閕PS細(xì)胞。Kim等[13]又嘗試僅以 Oct4的外源性表達(dá)來誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞，成功得到 iPS細(xì)胞，值得注意的是：小鼠神經(jīng)干細(xì)胞本身就高水平表達(dá)Klf4和c-Myc因子。雖然這些研究都成功得到 iPS細(xì)胞，但重編程的效率卻隨著轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目的減少而降低。

總之，本研究成功地從胎牛原始生殖嵴中克隆出牛 c-myc基因編碼序列，其核苷酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列與發(fā)表的牛 c-myc基因序列完全一致，為進(jìn)一步研究 c-myc基因功能以及下一步特定因子誘導(dǎo)牛體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕PS細(xì)胞的研究奠定了基礎(chǔ)。

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