徐雅君 曾慶友,2* 許瑞安*

（1 教育部分子藥物工程研究中心、華僑大學(xué)分子藥物學(xué)研究所，福建 泉州 362021；2 華僑大學(xué)化工學(xué)院，福建 泉州 362021）

細(xì)胞膜穿透肽（cell penetrating peptide，CPPs）是一些具有細(xì)胞穿透功能的短肽的統(tǒng)稱，一般少于30個氨基酸，其中堿性氨基酸占多數(shù)[1]。此外，CPPs還能幫助生物大分子穿過血腦屏障且無毒副作用[2,3]。CPP的這些特性使其成為一種有效的運輸載體，向細(xì)胞內(nèi)運送各種自身不能穿越細(xì)胞膜的大分子生物活性物質(zhì)，為生物治療提供了一個嶄新的有力工具。到目前為止，已有CPPs作為載體成功的將多肽、蛋白質(zhì)、DNA及siRNA等導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的報道[4-7]。但是隨著研究的深入，我們發(fā)現(xiàn)CPPs作為載體，存在與血液的不相容性，缺少組織特異性，易被內(nèi)體捕獲從而進(jìn)入溶酶體被降解等問題[8，9]，從而大大的降低了CPPs的轉(zhuǎn)染率，限制了其在腫瘤治療中的應(yīng)用。因此，有效解決上述問題是優(yōu)化CPPs在腫瘤治療中的作用的關(guān)鍵。

1 優(yōu)化CPP的體內(nèi)相容性

CPP本身具有生物組織相容性且無毒副作用。但是，在體內(nèi)給藥時，由于CPP中堿性氨基酸占多數(shù)，所以，其在生理pH 7.4條件下帶正電荷，易與血液發(fā)生作用，引起血栓，從而對人體造成傷害，甚至引發(fā)死亡[10,11]。因此，在用CPP作載體，進(jìn)行體內(nèi)給藥時，我們要首先對CPP進(jìn)行修飾來掩蓋其表面的正電荷。載體表面修飾，最常用的方法是聚乙二醇化，聚乙二醇不僅具有很好的生物相容性，還可以增強(qiáng)載體在體內(nèi)的穩(wěn)定性并延長其體內(nèi)循環(huán)時間，從而提高藥效。Morris等[12]將細(xì)胞膜穿透肽Pep-3聚乙二醇化，并證實了修飾后的Pep-3在體內(nèi)的穩(wěn)定性較未修飾的大大的提高了。Van Dongen等[13]也將細(xì)胞膜穿透肽Tat和聚乙二醇化聯(lián)合起來使用，來提高酶載納米反應(yīng)器的轉(zhuǎn)染率。

CPP本身是沒有組織特異性的，所以在進(jìn)行體內(nèi)給藥時，CPP會帶著負(fù)載的藥物會進(jìn)入所有組織，這樣就會使到達(dá)靶組織的藥物濃度減少[8,14,15]。此外，抗腫瘤藥物一般上對正常組織會有傷害作用，所以，在治療腫瘤的時候我們要盡量使抗腫瘤藥物具有靶向性，能直達(dá)腫瘤組織起作用。理論上來說，解決CPP的腫瘤靶向性的問題并不難，但實際上，解決這個問題是一難點。因為在組織中，CPP和接上的配體的作用是相互抑制的。Anderson等[16]將Fab片段與Tat相連，并證實Fab連接后的Tat確實具有細(xì)胞靶向性，但是這個研究同時也指出Fab抑制Tat的穿膜能力，而Tat也抑制Fab尋找靶細(xì)胞的能力，二者之間存在矛盾。如何解決CPP與配體之間的矛盾呢？首先，我們要考慮到二者的發(fā)揮作用的空間的差異，配體是在組織外作用，以達(dá)到尋找靶組織的目的；CPP是在細(xì)胞膜上起作用，以達(dá)到跨膜的目的。其次，我們要考慮到正常組織與靶組織之間的生理差異，如pH的不同，腫瘤特異的酶。最后，我們就可以根據(jù)上述兩方面得到一種可行的策略，對CPP進(jìn)行修飾改造。Jiang等[17]用陰離子多肽將聚精氨酸多肽掩蓋，從而使聚精氨酸不能發(fā)揮作用，進(jìn)入細(xì)胞；直到到了腫瘤組織，由于腫瘤組織特異性酶MMP2的存在，切斷了陰離子多肽與聚精氨酸之間的連接，聚精氨酸暴露發(fā)揮作用，從而進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。

因此，CPP作為載體應(yīng)用于體內(nèi)治療時，應(yīng)考慮先將CPP掩蓋，直至到達(dá)靶組織時，再將其釋放。這樣才能使CPP的作用得到很好的發(fā)揮，而且將對機(jī)體組織的傷害降到了最低。

2 精確CPP的跨膜過程

CPP最初被認(rèn)為是以非溫度依賴、非能量依賴、非受體依賴的方式進(jìn)入細(xì)胞的[18,19]。但從2003年后，人們逐漸發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)吞作用在CPP應(yīng)用試驗中的存在，并且最終確認(rèn)內(nèi)吞作用是CPP介導(dǎo)藥物進(jìn)入細(xì)胞的主要方式，而直接穿膜作用也是進(jìn)入細(xì)胞的方式之一[20,21]。因此，CPP介導(dǎo)的跨膜作用包括很多途徑，而途徑的選擇不僅與CPP種類及負(fù)載藥物的性質(zhì)有關(guān)，而且與靶細(xì)胞的種類有關(guān)[22-24]。此外，又由于至今為止CPP的跨膜機(jī)制還不明確，所以，對于目前的狀況來說，在細(xì)胞實驗前確定某一具體的CPP及其負(fù)載物進(jìn)入細(xì)胞的途徑幾乎是不可能的，而這種不確定又在很大程度上增加了時間的耗費和成本。解決這個問題的關(guān)鍵就是要明確CPP的跨膜機(jī)制。

目前已提出了很多CPP的跨膜機(jī)制，主要包括3類。第一種是通過靜電作用直接滲透通過細(xì)胞膜。具體過程為未折疊的CPP融合蛋白首先與細(xì)胞膜表面通過靜電方式結(jié)合，然后直接跨過細(xì)胞膜，接著在分子伴侶的幫助下發(fā)生重折疊[25,26]。這是針對早期研究發(fā)現(xiàn)的認(rèn)為CPP是非溫度依賴、非能量依賴、非受體依賴的非經(jīng)典內(nèi)吞方式的跨膜機(jī)制。第二種跨膜機(jī)制是通過形成某種跨膜結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞。這類機(jī)制包括3種可能的模式[27]：反轉(zhuǎn)微團(tuán)模式、地毯模式和打孔模式。第三種跨膜機(jī)制是內(nèi)吞作用介導(dǎo)入膜，這類機(jī)制是在發(fā)現(xiàn)CPP跨膜過程中涉及內(nèi)吞作用后提出的[28-30]。

雖然現(xiàn)在CPP的跨膜機(jī)制還不明確，但是其穿膜特性是肯定的。此外，人們還開始認(rèn)識到CPP的一次跨膜并不僅僅涉及一種跨膜機(jī)制[31]。有很多機(jī)制參與CPP的一次跨膜，重要的是哪種機(jī)制為主。因此，目前的重點是明確跨膜機(jī)制，然后根據(jù)其來改造CPP，使其主要按人們想要的那種機(jī)制跨膜。

3 促進(jìn)CPP 從內(nèi)體逃逸

雖然CPP的一次跨膜涉及很多機(jī)制，但是人們發(fā)現(xiàn)至今為止應(yīng)用的CPP負(fù)載藥物跨膜都以內(nèi)吞作用跨膜為主，而又由于內(nèi)吞作用跨膜時存在內(nèi)體捕獲和溶酶體降解的問題，所以，我們就要考慮如何幫助CPP及其負(fù)載物從內(nèi)體逃脫，以防止其進(jìn)入溶酶體，從而在溶酶體堆積或被降解[32,33]。

促進(jìn)CPP從內(nèi)體逃逸的方法主要有5種：①化學(xué)物質(zhì)輔助逃逸，如氯喹、Ca2+等。Wattiaux等[34]用熒光標(biāo)記Tat，并在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入氯喹，幾小時后在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)了熒光，首次證實了氯喹可以促進(jìn)CPP從內(nèi)體逃脫進(jìn)入胞質(zhì)，進(jìn)入細(xì)胞核。Shiraishi等[35]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入Ca2+能促進(jìn)CPP偶聯(lián)的PNA從內(nèi)體釋放。雖然Ca2+能明顯促進(jìn)CPP從內(nèi)體逃脫，但其作用機(jī)制仍不清楚。②光敏物質(zhì)輔助逃逸。光敏物質(zhì)能在可見光的激發(fā)下產(chǎn)生活性氧簇，而活性氧簇能破壞內(nèi)體膜，促進(jìn)內(nèi)體內(nèi)物質(zhì)釋放進(jìn)入胞質(zhì)。因此，應(yīng)用CPP作為載體運送生物活性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的同時給予光敏物質(zhì)可促進(jìn)內(nèi)含體內(nèi)含物的釋放。Endoh等[36]將siRNA連接到CPP上，在激光的照射下，CPP成功將siRNA導(dǎo)入到CHO細(xì)胞，誘導(dǎo)U1A基因的沉默。③天然或合成的聚合物輔助逃逸，例如蜂毒肽及人工合成的短肽如43E（LAEL-LAELLAEL）。Ogris等[37]將蜂毒肽結(jié)合到聚乙烯亞胺PEI上，形成MELPEI-DNA復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)蜂毒肽能促進(jìn)DNA從內(nèi)體釋放到胞質(zhì)，并引導(dǎo)其跨過核膜屏障進(jìn)入細(xì)胞核。④病毒微生物輔逃逸，例如流感病毒血凝素2蛋白（HA2）。一些病毒微生物在進(jìn)化過程中獲得了從內(nèi)體逃逸的本領(lǐng)，而這種逃逸與微生物自身元件在低pH值環(huán)境中，破壞內(nèi)含體溶酶體膜有關(guān)[38]。Sugita等[39]用熒光素標(biāo)記TAT，分別處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TAT單獨處理時熒光只是集中在內(nèi)體，而與TAT-HA2共處理后則發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中有大面積熒光。⑤ CPP自身改造促進(jìn)逃逸[40,41]。雖然上述5種方法能促進(jìn)CPPs及其負(fù)載物從內(nèi)體逃逸，但卻存在操作繁瑣、運送載體構(gòu)造復(fù)雜及毒副作用較大等缺點。因此，人們開始尋找更簡便、更安全的方法來促進(jìn)CPP的內(nèi)體逃逸，對現(xiàn)有CPPs進(jìn)行改造是最可行的方法。目前已提出很多關(guān)于CPP改造的方案，也已對很多方案進(jìn)行試驗驗證，雖然有所進(jìn)展，但仍缺少實質(zhì)性的突破。

5 結(jié)語與展望

細(xì)胞膜穿透肽可以有效地將多肽、蛋白質(zhì)及DNA片段等生物大分子導(dǎo)入多種哺乳動物細(xì)胞，且在一定濃度范圍內(nèi)不會造成細(xì)胞損傷。目前，雖然CPP在應(yīng)用過程中存在很多的問題，甚至CPP的跨膜機(jī)制也不明確，這是造成很多問題的關(guān)鍵。但是仍可以肯定CPP是生物活性分子有效的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運工具，而且我們有理由相信，經(jīng)過改造的CPP，未來的CPP將作為高效的生物藥物輸送載體，在疾病的預(yù)防、檢測及治療中發(fā)揮重要的作用[42]。

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