陶 青，趙俊龍

弓形蟲是世界范圍分布的專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，可感染人類和所有溫血?jiǎng)游锏挠泻思?xì)胞。由于宿主的廣泛性，弓形蟲病已經(jīng)成為一個(gè)全球性的、嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，不但危害人類健康，而且成為影響畜牧業(yè)發(fā)展的重要機(jī)會(huì)性病原體［1］。鈣離子（Ca2＋）是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使之一，在弓形蟲入侵宿主細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用［2］。弓形蟲速殖子內(nèi)Ca2＋被各種相關(guān)信號(hào)通路所調(diào)節(jié)并釋放到胞質(zhì)后激活依賴Ca2＋的蛋白激酶，進(jìn)而行使不同的細(xì)胞功能［3］。本文綜述了Ca2＋及其相關(guān)信號(hào)通路和蛋白激酶在弓形蟲獨(dú)特生理機(jī)制中的重要作用。

1 弓形蟲速殖子中Ca2＋生理特性和功能

Ca2＋濃度在靜止的弓形蟲細(xì)胞質(zhì)中保持著較低的水平，在弓形蟲速殖子運(yùn)動(dòng)過程中，Ca2＋水平的變化呈現(xiàn)周期性波動(dòng)趨勢(shì)［3］。胞內(nèi)Ca2＋貯存在三個(gè)鈣庫中，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和酸性鈣離子體，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是弓形蟲貯存Ca2＋最主要的部位。鈣庫對(duì)Ca2＋的緩沖作用很大，在調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)Ca2＋濃度中起到關(guān)鍵作用［2］。胞內(nèi)Ca2＋在受到外界刺激后，通過信號(hào)通路從鈣庫釋放到胞質(zhì)中。鈣庫上的鈣離子泵可將胞質(zhì)中的Ca2＋重新泵入鈣庫，一方面填充由于釋放Ca2＋導(dǎo)致的鈣庫的虧空，另一方面可以降低胞質(zhì)內(nèi)Ca2＋濃度，使胞內(nèi)Ca2＋水平始終處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)。近年的研究表明，大多數(shù)鈣離子泵是Ca2＋－ATP酶，弓形蟲體內(nèi)最重要的鈣泵是肌質(zhì)－內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Ca2＋－ATP酶（SERCA）。Nagamune等證實(shí)了SERCA在胞內(nèi)弓形蟲中位于蟲體頂端，便于通過調(diào)節(jié)Ca2＋水平來影響微線體蛋白的分泌作用，青蒿素或毒胡蘿卜內(nèi)酯可以通過抑制SERCA的Ca2＋－ATP酶活性來破壞蟲體胞內(nèi)Ca2＋的動(dòng)態(tài)平衡。因此，SERCA也成為重要的抗弓形蟲的潛在藥物靶標(biāo)［4］。此外，在弓形蟲體內(nèi)還有兩個(gè)Ca2＋載體，高爾基型 Ca2＋－ATP酶和單體 Ca2＋/H＋增強(qiáng)子，這些鈣離子泵共同保持著胞內(nèi)Ca2＋水平的穩(wěn)定。

Lovett等通過fluo－4熒光光度測(cè)定研究表明隨著弓形蟲胞內(nèi)Ca2＋濃度的增加，有關(guān)蟲體運(yùn)動(dòng)性的蛋白質(zhì)如微線體蛋白2（MIC2）開始分泌，而胞外Ca2＋不是弓形蟲運(yùn)動(dòng)性的必需因素。在弓形蟲滑行運(yùn)動(dòng)過程中，胞內(nèi)Ca2＋從鈣庫釋放，Ca2＋濃度隨蟲體運(yùn)動(dòng)周期性波動(dòng)，而蟲體在入侵宿主過程中和進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)的初期Ca2＋濃度驟降［5］。Wetzel等通過卡米達(dá)佐藥物刺激試驗(yàn)闡述了胞內(nèi)Ca2＋濃度在弓形蟲滑行過程中的周期性波動(dòng)伴隨著微線體蛋白的分泌，并且胞內(nèi)Ca2＋濃度周期性的波動(dòng)變化是弓形蟲運(yùn)動(dòng)的主要?jiǎng)恿ΑＤ承┧幬镌谟绊慍a2＋波動(dòng)振幅的情況下不會(huì)增強(qiáng)弓形蟲滑動(dòng)性，而增加波動(dòng)頻率則會(huì)顯著增加蟲體滑行運(yùn)動(dòng)［6］。

2 有關(guān)胞內(nèi)Ca2＋釋放的信號(hào)通路

弓形蟲鈣庫內(nèi)的Ca2＋通過兩個(gè)主要的信號(hào)通路—蘭尼堿樣通路和三磷酸肌醇通路［7］被釋放到胞質(zhì)中，激活相關(guān)蛋白激酶，行使第二信使的功能。

2.1 蘭尼堿樣信號(hào)通路 蘭尼堿樣通路被環(huán)化核苷酸二磷酸核糖（c ADPR）所調(diào)節(jié)［7］。弓形蟲受到包括宿主自然配體等外界刺激，體表接收器發(fā)出識(shí)別信號(hào)后激活c ADPR環(huán)化酶，使其行使環(huán)化功能，以NAD＋為原料催化合成c ADPR。c ADPR可作為第二信使結(jié)合到蘭尼堿樣受體，進(jìn)而激發(fā)鈣庫中的Ca2＋釋放到胞質(zhì)中。

2.2 三磷酸肌醇通路 以三磷酸肌醇（IP3）為第二信使的信號(hào)通路是弓形蟲體內(nèi)介導(dǎo)胞內(nèi)Ca2＋釋放的另一條重要途徑。Lovett等通過藥理學(xué)現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)乙醇作為天然的Ca2＋刺激劑，可以增加弓形蟲體內(nèi)的IP3含量［7］。與蘭尼堿樣信號(hào)通路相似，當(dāng)蟲體接觸宿主細(xì)胞配體或外界刺激后三磷酸肌醇信號(hào)通路被激活。底物磷脂酰二磷酸肌醇在磷脂酶C的作用下產(chǎn)生乙酰甘油，同時(shí)，釋放第二信使IP3到胞質(zhì)中來介導(dǎo)胞內(nèi)Ca2＋的釋放。

3 Ca2＋相關(guān)分泌蛋白及功能

Ca2＋做為胞內(nèi)重要的離子信號(hào)介導(dǎo)了多種弓形蟲生命過程中必不可少的一些分泌蛋白的釋放和調(diào)節(jié)，在弓形蟲的滑行運(yùn)動(dòng)、入侵和逃離過程發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

3.1 Ca2＋介導(dǎo)微線體蛋白2（MIC2）的分泌MIC2由弓形蟲微線體分泌，最初以小囊泡形式被分泌出來，當(dāng)弓形蟲與宿主細(xì)胞接觸后，微線體蛋白囊泡融合，定位在弓形蟲頂部表面［8］。在弓形蟲入侵過程中，MIC2分泌到蟲體頂部后在蛋白酶的水解作用下開裂為胞質(zhì)內(nèi)尾區(qū)、跨膜區(qū)和胞外尾區(qū)［9］。胞外尾區(qū)可與宿主細(xì)胞表面特異受體結(jié)合從而使弓形蟲粘附到宿主細(xì)胞表面。而胞質(zhì)內(nèi)尾區(qū)則與弓形蟲醛縮酶相互作用，并與肌動(dòng)蛋白相連接促發(fā)弓形蟲的運(yùn)動(dòng)能力。MIC2的分泌可以被Ca2＋載體激發(fā)，且只受到胞內(nèi)Ca2＋水平的影響，Wetzel等用卡米達(dá)佐刺激胞內(nèi)Ca2＋濃度升高可以顯著增加MIC2的含量，進(jìn)而促進(jìn)弓形蟲滑行運(yùn)動(dòng)，相反，當(dāng)螯合了胞內(nèi)Ca2＋后可抑制 MIC2的釋放［4］。

3.2 脫落酸（ABA）介導(dǎo)Ca2＋的釋放 最近的研究表明一種植物樣通路可以通過ABA控制蘭尼堿樣信號(hào)途徑來刺激Ca2＋的釋放，進(jìn)而使弓形蟲逃離宿主。ABA在頂器門寄生蟲中由類異戊二烯途徑衍生而來，在弓形蟲胞內(nèi)裂殖生殖過程中逐漸富集，導(dǎo)致c ADPR的增加而激活蘭尼堿樣通路，最終使胞內(nèi)Ca2＋不斷釋放而引發(fā)弓形蟲的逃離。Nagamune等用氟啶酮來封閉ABA的生物合成，導(dǎo)致弓形蟲無法逃離宿主細(xì)胞。由于ABA的缺乏，使弓形蟲對(duì)環(huán)境條件變化的敏感性增強(qiáng)，因此，促進(jìn)弓形蟲速殖子進(jìn)入一個(gè)慢性生長(zhǎng)的緩殖子分化時(shí)期，最終形成休眠狀態(tài)的組織包囊［10］。

3.3 Ca2＋介導(dǎo)穿孔素樣蛋白（PLP1）的分泌 弓形蟲速殖子的細(xì)胞逃離作用同樣需要另一種微線體蛋白的參與，即穿孔素樣蛋白（PLP1），同時(shí)要求胞內(nèi)Ca2＋的促發(fā)作用來助于PLP1的釋放。PLP1能夠?qū)蜗x自身的納蟲泡和宿主質(zhì)膜有裂解作用，使膜表面出現(xiàn)孔隙和缺口，有助于弓形蟲逃出宿主細(xì)胞。PLP1敲除的弓形蟲喪失了從納蟲泡釋放速殖子的能力，說明PLP1對(duì)弓形蟲正常生長(zhǎng)和免疫逃避至關(guān)重要。Kafsack等證明了PLP1由微線體釋放，并依賴Ca2＋濃度的調(diào)節(jié)。當(dāng)加入Ca2＋載體后PLP1分泌量顯著增加，并隨著Ca2＋濃度的逐漸升高而增加。用胞內(nèi)Ca2＋螯合劑去除胞內(nèi)Ca2＋后，PLP1的分泌也被封閉［11］。另外，弓形蟲可以通過感受胞內(nèi)鉀離子（K＋）水平的降低來感知宿主細(xì)胞外界或自身引起的損壞，隨后，一系列的Ca2＋壓力通路被激活釋放Ca2＋來調(diào)節(jié)弓形蟲逃離宿主細(xì)胞。

4 Ca2＋相關(guān)激酶和功能

弓形蟲速殖子的滑行運(yùn)動(dòng)、宿主細(xì)胞入侵和逃離是弓形蟲整個(gè)生活史中的關(guān)鍵生命進(jìn)程，亦是弓形蟲急性致病的主要原因。弓形蟲的所有運(yùn)動(dòng)過程都需要MIC2的細(xì)胞粘附作用，而MIC2的釋放是受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)控制的，這樣才能避免宿主機(jī)體免疫系統(tǒng)的清除作用。一些蛋白激酶在Ca2＋信號(hào)的激活作用下，對(duì)MIC2的分泌調(diào)節(jié)起到了重要作用。早期的研究證明至少有兩種不同的蛋白激酶控制著MIC2的分泌，分別是環(huán)GMP依賴激酶，即蛋白激酶G（PKG）和鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）。

4.1 絲氨酸/蘇氨酸激酶對(duì)微線體蛋白分泌的作用

蛋白激酶G（PKG）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，在Ca2＋的激活下成為促使微線體蛋白分泌的重要途徑。Wiersma等用一種叫做Cmpd 1的選擇性寄生蟲抑制劑來封閉PKG的作用［12］。Cmpd 1是一種吡咯－吡啶化合物，可抑制弓形蟲MIC2的分泌，從而抑制弓形蟲的細(xì)胞入侵和運(yùn)動(dòng)力。在Ca2＋存在的環(huán)境下，隨著加入Cmpd 1的濃度升高，MIC2的分泌逐漸減少，當(dāng)螯合了胞內(nèi)Ca2＋后，MIC2的分泌被完全封閉。由于弓形蟲的細(xì)胞入侵和滑行運(yùn)動(dòng)都要依賴于MIC2的分泌，PKG的蛋白質(zhì)磷酸化作用無論在微線體蛋白對(duì)膜結(jié)構(gòu)的錨定作用中還是在弓形蟲頂部與膜結(jié)構(gòu)的融合中都發(fā)揮了重要作用。然而PKG作為分子藥物靶標(biāo)在體內(nèi)還未得到證實(shí)，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

4.2 鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）的結(jié)構(gòu)和作用 作為Ca2＋信號(hào)的重要效應(yīng)因子，CDPKs家族的蛋白激酶承擔(dān)了刺激微線體蛋白釋放的主要任務(wù)。胞內(nèi)Ca2＋水平增加激活CDPKs作用于微線體，促使微線體蛋白的釋放。CDPKs廣泛存在于植物、纖毛蟲及原生動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，而不存在于動(dòng)物和真菌［13］，因此，CDPKs作為有效的藥物靶標(biāo)更優(yōu)于任何一種動(dòng)物體內(nèi)所含有的蛋白激酶。

典型的CDPKs結(jié)構(gòu)在氨基端有一個(gè)可變區(qū)與催化區(qū)域相連接，在羧基端則擁有一個(gè)激活區(qū)域（CAD），CAD由連接區(qū)和調(diào)節(jié)區(qū)（鈣調(diào)蛋白樣區(qū)域）構(gòu)成［13］。CAD是CDPKs最重要的功能區(qū)域，調(diào)節(jié)著整個(gè)蛋白激酶的活化和抑制形式，這是由于此區(qū)域羧基端包含典型的EF hand結(jié)構(gòu)。EF hand可以結(jié)合Ca2＋使處于抑制狀態(tài)的CDPKs激活而行使蛋白激酶功能，而連接催化區(qū)和調(diào)節(jié)區(qū)的連接區(qū)亦叫做自動(dòng)抑制區(qū)，該區(qū)域以假底物的形式結(jié)合到催化區(qū)使蛋白激酶處于抑制狀態(tài)［13］。CDPKs執(zhí)行功能需要ATP提供能量，在催化區(qū)域內(nèi)的ATP結(jié)合位點(diǎn)中擁有一個(gè)獨(dú)特的看門氨基酸殘基，是控制蛋白激酶發(fā)揮作用的中樞部位，當(dāng)看門氨基酸殘基突變后就會(huì)影響激酶與ATP或激酶抑制劑的結(jié)合，導(dǎo)致蛋白激酶的失活或?qū)σ种苿┟舾行越档停?4］，從而影響微線體蛋白的釋放。Ojo等用一種特殊的蛋白激酶抑制劑BKLs來封閉TgCDPK1的活性，使BKLs與ATP形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系而結(jié)合到ATP結(jié)合位點(diǎn)。而將TgCDPK1的看門氨基酸殘基半胱氨酸突變?yōu)樘於彼岷?，由于改變了ATP結(jié)合位點(diǎn)的空間大小而明顯降低了TgCDPK1對(duì)BKLs的敏感性［14］，因此，開發(fā)CDPKs的選擇性抑制劑具有廣闊的前景。

與植物中CDPKs相似，弓形蟲的CDPKs結(jié)構(gòu)也變化多樣，和植物與纖毛蟲中典型的CDPKs結(jié)構(gòu)相比較，并以催化區(qū)域?yàn)榛A(chǔ)，TgCDPKs結(jié)構(gòu)可分為5個(gè)主要類型［3］。典型的結(jié)構(gòu)包括氨基端的激酶催化區(qū)域和羧基端的4個(gè)EF hand。第二類典型的TgCDPKs除了包含4個(gè)EF hand外，在催化區(qū)域的氨基端有一段稍長(zhǎng)的未乙酰化的部分，功能未知。另外一類只擁有3個(gè)EF hand，這種結(jié)構(gòu)與植物的鈣離子－鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶（CCa MK）相似［15］。第四類TgCDPKs的EF hand在催化區(qū)域的氨基端，且EF hand的個(gè)數(shù)可以是一個(gè)或者更多。最后，弓形蟲還擁有一大類特殊的CDPKs，除了具有典型的CDPKs結(jié)構(gòu)外，在氨基端還有兩個(gè)或更多的EF hand，同時(shí)，有一個(gè)plekstrin homology（PH）區(qū)域連接了EF hand和催化區(qū)域。由于TgCDPKs結(jié)構(gòu)各異，表明其功能多種多樣，對(duì)TgCDPKs的結(jié)構(gòu)和功能研究成為當(dāng)今弓形蟲研究的熱點(diǎn)。

5 結(jié) 語

弓形蟲Ca2＋信號(hào)通路和相關(guān)蛋白激酶的作用機(jī)制是十分復(fù)雜的，但在弓形蟲整個(gè)生活史中起到了至關(guān)重要的作用。Ca2＋和相關(guān)蛋白激酶不僅參與了弓形蟲速殖子從滑行運(yùn)動(dòng)、宿主細(xì)胞入侵和逃離的整個(gè)過程，而且宿主細(xì)胞對(duì)Ca2＋的通透性也是宿主抵抗弓形蟲的重要步驟。在弓形蟲的所有運(yùn)動(dòng)過程中，Ca2＋通過蘭尼堿樣通路和三磷酸肌醇通路釋放到胞質(zhì)內(nèi)，被釋放的Ca2＋結(jié)合PKG和CDPKs導(dǎo)致微線體蛋白的分泌，Ca2＋與相關(guān)蛋白激酶促發(fā)微線體蛋白的釋放，這在弓形蟲獲得運(yùn)動(dòng)能力中起到關(guān)鍵作用。MIC2的細(xì)胞表面粘附作用使弓形蟲具有入侵和逃避宿主細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性。Ca2＋及其相關(guān)蛋白激酶已成為如今研究弓形蟲致病機(jī)制的熱點(diǎn)，現(xiàn)有的研究結(jié)果和資料對(duì)整個(gè)Ca2＋信號(hào)通路和蛋白激酶作用機(jī)理的闡述不足以精確描述整個(gè)過程的作用機(jī)制，如弓形蟲其他分泌器官的新蛋白的功能研究，Ca2＋其他受體對(duì)整個(gè)信號(hào)通路的作用機(jī)制等。

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